来曲唑诱导的多囊卵巢综合征大鼠模型粪菌移植实验研究

林 青,邢 玉,刘艳霞,佟 庆,陈 雨,徐道立,祁 冰

(北京中医药大学东方医院,北京 100078)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种以内分泌紊乱为主、多种代谢异常导致的异质性临床综合征,我国育龄期妇女中PCOS发病率逐步攀升［1］。PCOS患者生理、心理承受双重负担,但关于PCOS的发病机制却众说纷纭,也无特效治疗药物。针对PCOS的病因、病理改变、发病机制以及治疗方法、治疗靶点的研究有着深远的意义。大量研究证实,人体代谢水平与肠道菌群有着十分密切的关系［2］。肠道菌群通过与外界环境相互作用,促进新陈代谢、免疫反应和改善肠道结构,被认为是PCOS发病关键一环［3］,调节肠道内环境对PCOS有重要意义。粪菌移植实验是研究肠道内环境对于各种疾病发生发展影响的重要途径。本实验旨在通过粪菌移植实验,探讨来曲唑诱导的PCOS大鼠模型肠道菌群是否可以引起PCOS的发生,为后续研究PCOS的发病机制提供基础。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级6周龄雌性SD大鼠12只,体重(180±15)g;SPF级3周龄雌性SD大鼠20只,体重(100±10)g。大鼠均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物许可证号:SCXK(京)2016-0006。常规饲养于北京中医药大学SPF级屏障环境,12 h光照/黑夜循环,温度25 ℃,湿度60%,自由摄食饮水。

1.2实验药物 来曲唑片(江苏恒瑞医药股份有限公司,批号:190316KG),卡那霉素(索莱宝生物科技有限公司,货号:K8020),庆大霉素(索莱宝生物科技有限公司,货号:G8170),多黏菌素B(索莱宝生物科技有限公司,货号:P8350),万古霉素(索莱宝生物科技有限公司,货号:V8050),灭滴灵(索莱宝生物科技有限公司,货号:M8060)。

1.3实验仪器与试剂 离心机(恒诺仪器,AXTGL16M),切片机(Leica,RM2235),石蜡包埋机(Leica G1150H),电子天平(Sartorius公司,Cubis®MSA224S-000-DA),电热恒温水浴槽(上海一恒 恒温设备厂,HWS-24),制冰机(SCOTSMAN,AF10),旋涡混匀器(海门麒麟医用仪器厂,XW-80A型),ChemiDoc MP化学发光成像系统(Bio-rad,170-8280),γ放射免疫计数器(西安核仪器厂,XH-6080),全自动酶标仪(THERMO V.2.3),微量分光光度计(杭州佑宁仪器有限公司,NanoOne)。血清雄激素测定试剂盒(北京北方生物技术研究所,批号:20190602),血糖酶法试剂盒(北京百奥泰康生物技术有限公司,批号:DL201901),无水乙醇(国药集团国瑞药业有限公司,批号:10009218),异丙醇(国药集团国瑞药业有限公司,批号:40064360),DEPC水(MDL,批号:md911875)。

1.4实验方法 6周龄大鼠适应性喂养7 d后,按随机数字表法随机分为空白组、模型组各6只。3周龄大鼠适应性喂养7 d后,按随机数字表法随机分为粪菌移植模型组、粪菌移植对照组,每组10只。将来曲唑1 mg/(kg·d)溶于1%羧甲基纤维素(CMC)中,模型组大鼠连续灌胃21 d复制PCOS大鼠模型,空白组大鼠同期灌胃等体积等浓度基质CMC。在6周龄大鼠灌胃的第17天起,3周龄大鼠开始喂食抗生素混合饮水(卡那霉素0.4 mg/mL、庆大霉素0.035 mg/mL、多黏菌素850 IU/mL、灭滴灵0.215 mg/mL 、万古霉素0.045 mg/mL),连续5 d,建立伪无菌大鼠模型(肠道菌群DNA总量明显降低)［4］。第22天开始,空白组每日灌胃等体积CMC,模型组每日灌胃等体积来曲唑药液1 mg/(kg·d),粪菌移植对照组每日灌胃等体积空白组大鼠新鲜粪便混悬液2 g/(kg·d)(收集4 g空白组大鼠新鲜粪便,于20 mL生理盐水中混匀,3 min后灌胃),粪菌移植模型组每日灌胃等体积模型组大鼠新鲜粪便混悬液2 g/(kg·d)(制备方法同粪菌移植对照组),均每日1次,连续21 d。

1.5取材 末次灌胃后,大鼠饥饿12 h,腹腔注射0.4%戊巴比妥(1 mL/100 g)麻醉,打开腹腔,腹主动脉取血后摘取双侧卵巢,左侧卵巢置于4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片,HE染色,镜下观察,右侧卵巢液氮保存。

1.6检测指标及方法

1.6.1大鼠形态 记录各组大鼠干预前1 d、干预21 d后和干预42 d后体重、身长(鼻尖至肛门的距离),计算干预前1 d和干预42 d后Lee’s指数［5］。Lee’s指数=3√体重(g)×103/体长(cm)。

1.6.2大鼠动情周期 监测空白组和模型组(开始干预的第16～20天、第36～42天)、粪菌移植模型组和粪菌移植对照组(移植第1～7天)大鼠阴道脱落细胞涂片,观察大鼠动情周期的变化,绘制动情周期曲线图。动情间期:细胞总数较为稀少,以白细胞为主,偶见一些有核上皮细胞;动情前期:膨大呈椭圆形的有核上皮细胞占绝大多数,偶见少量白细胞和角化上皮细胞;动情期:绝大多数为外形不规则的角化上皮细胞,聚集在一起形成堆状,镜下观察如落叶状,可见极少量白细胞和有核上皮细胞;动情后期:不规则角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞均可见,且比例相当［6］。

1.6.3血清睾酮及空腹血糖水平 末次灌胃后,大鼠饥饿12 h,腹腔注射0.4%戊巴比妥(1 mL/100 g)麻醉,腹主动脉取血4 mL,1 500 r/min离心5 min,取血清,放射免疫法检测4组大鼠血清睾酮水平,生化法检测空白组和模型组大鼠空腹血糖水平。

1.6.4卵巢形态和病理形态 取血后摘取双侧卵巢,立即称重,测量双侧卵巢长(A)、宽(B)和厚(C),计算卵巢体积(卵巢体积=0.52×A×B×C)。左侧卵巢置于4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片,HE染色,镜下观察病理形态。

1.7统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。实验数据符合正态分布且方差齐用ANOVA检验,若P<0.05采用LSD进行两两比较;如果数据不符合正态分布或方差不齐则采用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1空白组与模型组大鼠形态比较 干预前,2组大鼠体重和Lee’s指数比较差异均无统计学意义(P均>0.05);干预21 d后,模型组大鼠体重明显高于空白组(P<0.05);干预42 d后,模型组大鼠体重和Lee’s指数均明显高于空白组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组与多囊卵巢综合征模型组大鼠干预前后体重和Lee’s指数比较

2.2空白组与模型组大鼠动情周期比较 干预第16～20天,空白组大鼠均观察到完整动情周期,见图1;模型组大鼠规律动情周期已经消失,发情期缩短或者未监测到完整动情周期,见图2。干预第36～42天,空白组大鼠仍然可观察到完整动情周期,动情周期波动与干预5 d后基本保持一致,见图3;模型组大鼠未见规律动情周期,动情周期紊乱或发情期缩短,动情周期波动与干预5 d后相吻合,见图4。(图1～4中,纵坐标E代表动情期,P代表动情前期,M/D代表动情后期/动情间期)

图1 干预第16～20天空白组大鼠动情周期折线图

图2 干预第16～20天模型组大鼠动情周期折线图

图3 干预第36～42天空白组大鼠动情周期折线图

图4 干预第36～42天模型组大鼠动情周期折线图

2.3空白组与模型组大鼠血清睾酮和空腹血糖水平比较 空白组与模型组大鼠血清睾酮水平分别为(0.75±0.14)ng/mL、(2.00±1.15)ng/mL,模型组明显高于空白组(P<0.05);空白组与模型组大鼠空腹血糖水平分别为(8.17±1.19)mmol/L、(9.70±0.41)mmol/L,2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

(2)对圈员定期进行培训,培训穿刺针的拔除方法以及拔出后对穿刺点的压迫方法,并加强训练。在拔出穿刺针后,叮嘱患者等几分钟后再离开病床,避免用力过大崩开胶带,导致出血。还要告知患者透析间期居家发生渗血的处理方法。

2.4空白组与模型组大鼠卵巢形态比较 模型组大鼠右侧卵巢重量及双侧卵巢体积均明显高于空白组(P均<0.05),左侧卵巢重量与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 空白组与多囊卵巢综合征模型组大鼠卵巢重量和卵巢体积比较

2.5空白组与模型组大鼠卵巢组织HE染色表现空白组大鼠卵巢可见优势卵泡和黄体;模型组大鼠可见数个囊状卵泡,未成熟卵泡数量一个切面内大于12个,未见优势卵泡及黄体,卵泡明显减小,可见闭锁卵泡,囊泡颗粒细胞层较空白组明显变薄。见图5。

图5 空白组与多囊卵巢综合征模型组大鼠卵巢组织HE染色表现(×40)

2.6粪菌移植对照组与粪菌移植模型组大鼠形态比较 2组大鼠粪菌移植前后体重、Lee’s指数组间及组内比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 粪菌移植对照组与粪菌移植模型组大鼠体重、Lee’s指数比较

2.7粪菌移植对照组与粪菌移植模型组大鼠动情周期比较 粪菌移植对照组大鼠均观察到完整动情周期,动情周期波动规律,见图6;部分粪菌移植模型组大鼠未见规律动情周期,出现动情周期紊乱、发情期缩短或未观察到完整动情周期,少部分观察到规律波动的完整动情周期,见图7。

图6 移植后第15～21天粪菌移植对照组大鼠动情周期折线图

图7 移植后第15～21天粪菌移植模型组大鼠动情周期折线图

2.8粪菌移植对照组与粪菌移植模型组大鼠血清睾酮水平比较 粪菌移植对照组与粪菌移植模型组大鼠血清睾酮水平分别为(1.00±0.35)ng/mL、(1.51±0.75)ng/mL,2组比较差异无统计学意义(P>0.05),但粪菌移植模型组大鼠血清睾酮水平较粪菌移植对照组有明显上升趋势。

2.9粪菌移植对照组与粪菌移植模型组大鼠卵巢形态比较 粪菌移植后,粪菌移植模型组大鼠双侧卵巢重量、卵巢体积均较粪菌移植对照组不同程度增高,但2组只有右侧卵巢重量比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 粪菌移植对照组与粪菌移植模型组大鼠卵巢重量和卵巢体积比较

2.10粪菌移植对照组与粪菌移植模型组大鼠卵巢组织HE染色表现 2组大鼠卵巢形态未见明显病理学差异,均可见优势卵泡与黄体,粪菌移植模型组大鼠卵巢卵泡数稍多于粪菌移植对照组。见图8。

图8 粪菌移植对照组与粪菌移植模型组大鼠卵巢组织HE染色表现(×40)

3 讨 论

目前PCOS大鼠模型的建立主要有雄激素联合胰岛素造模法、胰岛素联合HCG造模法、芳香化酶抑制剂造模法、雄激素造模法、胰岛素类造模法、孕激素联合HCG造模法、雄激素联合HCG造模法等［7］,其中外源性雄激素法造模使用较多的雄激素有脱氢表雄酮(DHEA)、双氢睾酮(DHT)和丙酸睾酮(TP)［8］,芳香化酶抑制剂造模法主要应用的药物是来曲唑。本实验选取来曲唑作为PCOS大鼠模型建立的药物,原因如下:①来曲唑建立的PCOS大鼠模型生育功能降低,卵巢卵泡增多,出现排卵障碍,体重明显升高,出现雄激素升高、胰岛素抵抗、血脂异常等,此造模方法经济实惠、操作简单,可以长期操作,模型稳定。②在后期粪菌移植的过程中,提供移植粪便样本的模型组大鼠仍需每日灌服造模药物。来曲唑血清终末消除相半衰期约2 d,其清除主要通过代谢成无药理作用的羟基代谢产物,而且几乎所有代谢产物和约5%原药通过肾脏排泄。此种代谢方式可以排除粪菌移植过程中模型组大鼠肠道代谢造模药物的干扰,保证移植的模型组粪便样本中基本不存在具有药理作用的造模药物。因此,本研究选用来曲唑进行造模。

本研究中,空白组和模型组大鼠干预前体重、Lee’s指数均无明显差异,经过连续21 d来曲唑给药,模型组大鼠体重较空白组大鼠显著增加,动情周期紊乱,初步判断PCOS大鼠模型建立成功,可以进行后续粪菌移植操作。连续42 d来曲唑给药后,模型组大鼠体重、Lee’s指数继续上升,未监测到完整动情周期或发情期明显缩短,部分大鼠动情周期消失,血清睾酮水平显著高于空白组,结合模型组双侧卵巢体积、重量变化,HE染色卵巢也接近PCOS病理变化,按照PCOS临床诊断标准［9］,可以判断PCOS大鼠模型建立成功。

在粪菌移植实验前,多对实验动物进行抗生素预处理,以排除实验动物自带肠道菌群对于粪菌移植结果的干扰。Qi等［10］对21日龄小鼠粪菌移植实验前先给予抗生素治疗4 d,后成功粪菌移植出类PCOS症状大鼠。Uchiyama等［11］和Bhowmik等［12］的实验采取的抗生素预处理方案为万古霉素200 mg/kg、甲硝唑200 mg/kg、新霉素200 mg/kg,卞恒娟等［13］复制了该方案,对8周龄雄性大鼠每3 d喂食1次抗生素混合饮水,联合高脂饲料成功建立肥胖大鼠模型。本研究为了后期观察大鼠动情周期和卵巢变化,实验动物采用尚未性成熟的3周龄大鼠,同时参考本院抗生素预处理成功经验［4］,选择抗生素方案为卡那霉素0.4 mg/mL、庆大霉素0.035 mg/mL、多黏菌素850 IU/mL、灭滴灵0.215 mg/mL以及万古霉素0.045 mg/mL,上述抗生素按比例混入大鼠日常饮水中,连续喂食5 d后,大鼠肠道菌群DNA总量明显低于抗生素处理前,提示伪无菌大鼠模型的建立成功。

粪菌移植后,虽然粪菌移植模型组大鼠体重、Lee’s指数与粪菌移植对照组比较差异不明显,少部分大鼠仍存在规律动情周期,卵巢HE染色未出现明显多卵泡样改变,但部分大鼠已出现动情周期紊乱,雄激素水平升高,双侧卵巢重量、体积不同程度增加的情况,出现部分类似PCOS症状,不排除延长移植时间实验结果阳性可能及移植失败可能。但尚不可将此结果评价为已成功移植出PCOS大鼠,仅能认为来曲唑介导的PCOS大鼠模型肠道菌群可能导致PCOS的发生。

本实验为今后研究肠道菌群在PCOS发生发展中起到的作用提供了基础和经验。由于时间、经费、人力等各种影响,本研究只能局限于大鼠实验,且大鼠样本量不足,实验结果存在误差;本次粪菌移植实验结果未能完全满意,考虑可能是移植时间过短,或者粪便移植标本处理方法需要改良,比如研磨不够或加以离心后灌服粪液。由于经费问题,本实验未继续研究各组大鼠肠道菌群的细致变化。大量文献表明,PCOS患者肠道微生物中柔膜菌ML615J-28、类杆菌S247、拟杆菌丰度降低［14-16］,厚壁菌丰度提高,肠道菌群α多样性降低［17］。今后实验可以着重针对上述菌种,展开菌种定向移植实验,明确肠道菌群在PCOS发病中的变化,为临床提供治疗方向和靶点。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。