液质联用法测定部分原料中的阿维菌素

2023-07-29王亚会李祥波

食品工业 2023年7期

王亚会，李祥波

上海太太乐食品有限公司（上海 200000）

阿维菌素（avermectin）是一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，其药物已成为高毒有机磷农药的替代品，被广泛应用于作物种植与动物养殖中，其作用计量小，但脂溶性较高，降解比较缓慢，导致此药物在动物体内残留时间长，可能给食品安全带来隐患，世界卫生组织将其列为高毒化合物[1-5]。

许多国际组织和国家（地区）对阿维菌素残留量进行限制，欧盟规定各种蔬菜、水果及谷物中最大残留量（MRL）为20 μg/kg，日本规定梨中的MRL为20 μg/kg[6]。我国对不同类别的食品规定的阿维菌素的MRL也不同，如精制芝麻、大蒜、洋葱、姜、胡椒的MRL为50 μg/kg，小葱的MRL为100 μg/kg，干辣椒的MRL为200 μg/kg[7]。受利益的驱使，仍有养殖户违法超标使用阿维菌素。对植物过量喷洒阿维菌素驱虫一旦在组织中蓄积人类食用后也会产生危害[5]。针对精制芝麻、大蒜、胡椒、小葱、干辣椒等生产原料，为确保供应原料的食用安全，更为了保障消费者的切身利益，研究阿维菌素药物残留含量的检测方法具有重要的现实意义。

试验对农业部1025号公告-5-2008动物性食品中阿维菌素类药物残留检测中的液相色谱-串联质谱法进行优化，建立用液相色谱-串联质谱法测定部分蔬菜及香辛料中的检测方法，为产品质量安全的有效监管提供技术支撑。

图1 阿维菌素的化学结构式

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

乙腈、甲醇、丙酮、无水硫酸钠、甲酸、乙酸铵、正己烷（均为色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；阿维菌素标准品（纯度≥98%，上海安谱实验科技股份有限公司）；试验用水为超纯水。

精制芝麻（河南驻马店）、大蒜（山东冠县）、胡椒（泰州）、小葱（云南玉溪）、干辣椒（河北鸡泽县）。

液相三重四极杆串联质谱联用仪（1200 G1312B/G6460A）；电子天平（ML303，梅特勒）；电子天平（XS105DU，梅特勒）；涡旋混合器（VORTEX GENIUS3，德国IKA公司）；旋转蒸发仪（R-210/V-700/V850，BUCHI实验仪器公司）；离心机（TG16-WS，长沙湘仪离心机仪器有限公司）；0.22 μm滤膜、Zorbax SB C18（50 mm×2.1 mm×1.8 μm）、C8固相萃取柱（500 mg、6 mL）、C18固相萃取柱（60 mg、3 mL），PSA固相萃取柱（60 mg、3 mL）（均为上海安谱科学仪器公司）。

1.2 标准品配制

1.2.1 阿维菌素准储备溶液

准确称取一定量阿维菌素准物质，用甲醇配成1.00 mg/mL的标准贮备溶液。于-18 ℃避光保存，保存期为1年。

1.2.2 标准储备溶液

吸取阿维菌素准储备溶液，用甲醇配成10 μg/mL。于-18 ℃避光保存，保存期3个月，使用前回温到室温。

1.2.3 标准工作溶液

根据需要，临用前吸取一定量的混合标准储备溶液，用甲醇-水（1︰1，V/V）稀释配制成浓度梯度依次为5，10，25，50，100和200 μg/L的混合标准工作液。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Zorbax SB C18柱（50 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流动相为乙腈、水（0.1%甲酸，2 mmol/L乙酸铵）；柱温35 ℃；进样量5 μL。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

1.3.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测（MRM）；雾化气（NEB）、气帘气（CUR）、辅助加热气（AUX）、碰撞气（CAD）均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；Q1，Q3均为单位分辨率（UNIT）；定性离子对、定量离子对、碰撞气电压、去簇电压，见表2。

表2 阿维菌素质谱参数

1.4 样品前处理

1.4.1 样品提取

从全部的样品中取出约0.5 kg具有代表性样品，充分搅碎，混匀，均分成2份，分别装入洁净的容器内。密封作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。将试样于-18 ℃冷冻保存。

准确称取2 g样品，精确至0.01 g，置于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈，振荡提取2 min，按4 000 r/min离心5 min，将上清液转移到另一50 mL离心管中，残渣用15 mL乙腈重复提取1次，按4 000 r/min离心5 min，合并2次提取液转移至250 mL梨形瓶中，40 ℃水浴温度下旋蒸至干。加3 mL乙腈︰水（1︰2，V/V）溶液，蜗旋震动1 min溶解残渣，转移至15mL离心管中，加3 mL乙腈︰水（1︰2，V/V）溶液至梨型瓶中，蜗旋震动1 min溶解残渣，转移至15 mL离心管中，合并2次溶解液，待净化。

1.4.2 样品净化

依次用3 mL乙腈、3 mL乙腈︰水（4︰6，V/V）活化C8固相萃取小柱，将提取液过柱，弃去滤液，依次用3 mL乙腈︰水（4︰6，V/V），3 mL正己烷淋洗小柱，过完后减压抽干，用6 mL乙腈洗脱。将洗脱液40 ℃氮气吹干后，用1 mL乙腈+水溶液（1+1，V/V）溶解，过0.22 μm膜后供液质仪器分析

1.5 结果结算

式中：X为样品中待测组分残留量，μg/kg；X1为样品中待测组分含量，μg/L；W为样品实际称样量，g；V为样品最终定容体积，mL。

1.6 数据分析

所有数据以平均值表示，用Excel绘制各物质含量变化图。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

文献中对于阿维菌素检测离子对的报道较多，但是质谱仪的结构及设计不同，相关的电压也不相同。将质量浓度1 mg/mL的阿维菌素标准储备液稀释至0.1 μg/mL，采用蠕动泵直接进样方式，分别在正离子（ESI+）、负离子（ESI-）模式下进行Q1母离子全扫描。结果表明，阿维菌素在ESI+模式下具有较高的响应值。分别考察喷雾电压、雾化温度、气帘气、雾化气、辅助气对离子响应强度的影响，同时对各分子离子进行子离子扫描，选取合适的离子对，在MRM模式下优化簇电压和碰撞电压。最终选定最优参数见表2中质谱条件，质谱图见图2。

图2 阿维菌素质谱图（0.1 μg/mL）

图3 阿维菌素标准品色谱图（0.1 μg/mL）

2.2 提取溶剂的选择

阿维菌素为脂溶性化合物，难易溶于水，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、乙醇。比较甲醇、乙腈和丙酮作为样品提取剂的提取效果，试验结果显示，用丙酮提取时因干辣椒、胡椒、小葱含有色素，提取液的颜色深。甲醇对于含水量高的样品，加入无水硫酸钠后分离效果较差，综上选择乙腈作为提取溶剂。

2.3 净化方法优化

阿维菌素为弱极性物质，测定样品时，乙腈提取液中含有的极性色素、脂肪是主要干扰物质，固相微萃取技术（SPE）可有效去除色素。选择常用的C18、C8、PSA固相萃取柱进行比较。C18固相萃取小柱基于键合的反相（二甲基十八碳硅烷）、不规则硅胶（硅胶基）颗粒。这种非极性、未封端的吸附剂提供与表面硅醇基相关联的额外极性相互作用，因此C18具有良好的除脂能力。C8在吸附剂上与C18键合相类似，主要依靠非极性碳键相互作用。但由于C8烷基链较C18烷基链短，所以对非极性化合物保留弱于C18，有助于对非极性或弱极性吸附过强的样品的洗脱。PSA有2个氨基（伯胺和仲胺），且2个氨基的pKa值更高（分别是10.1和10.9），对极乙腈提取液中的脂肪酸、性色素可有效去除。

结果表明，阿维菌素的回收率C18固相萃取小柱优于PSA，C8优于C18。

图4 不同固相萃取小柱阿维菌素药的回收率（n=6）

2.4 色谱条件优化

阿维菌素为弱极性物质，易在反向色谱柱中保留，故选则Zorbax SB C18（50 mm×2.1 mm×1.8 μm），试验采用常用的乙腈-水溶液作为色谱的流动相，但结果表明，阿维菌素化合物在C18色谱柱上峰形较差，拖尾严重，基线噪声较大；在水相中加入0.1%（V/V）的甲酸后，阿维菌素在色谱柱上的基线噪声明显降低，提高了检测灵敏度，水相中加入2 mmol/L的乙酸铵时，阿维菌素的色谱峰型得到更好的改善，推测甲酸的加入能在一定程度上提高其在C18柱上的保留行为，因此选择水（0.1%甲酸，2 mmol/L乙酸铵）-乙腈为流动相。

2.5 方法的线性范围、相关系数、检出限、定量限

采用外标法定量，以分析物的峰面积（y）和对应的质量浓度（x，μg/L）进行线性回归计算，得到线性方程和相关系数。线性范围为5~200 μg/L，阿维菌素的相关系数r大于0.995，通过向阴性样品中添加标准品考察方法的检出限、定量限，信噪比≥3为检出限，信噪比≥10为定量限；每个标准品的添加量为0.2，0.5和1 μg/kg 3个水平，测得阿维菌素的检出限为0.2 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg。检出限、定量限、线性相关系数、线性方程、回收率见表3。

表3 阿维菌素的线性范围、回归方程、方法检出限和定量限

2.6 方法的回收率与精密度

阿维菌素在各检测样品中规定最高残留限量（MRL），参考GB/T 27404—2008中的相关规定，对于已制定MRL，回收率和精密度都应在方法测定底线、MRL、选一合适点进行三水平测试，即选择精制芝麻、大蒜、胡椒在0.2，0.5和50 μg/kg加标水平，小葱在0.2，0.5和100 μg/kg的加标水平，干辣椒的在0.2，0.5和200 μg/kg的加标水平进行加标回收率和精密度试验，重复测定至少6次。每个添加水平平行测定6次，结果见表4。精制芝麻在0.2，0.5和50 μg/kg加标水平下加标回收率范围分别为76.72%~96.11%，85.47%~100.02%和91.45%~110.25%，相对标准偏差（SRSD）分别为6.93%，6.28%和6.92%。大蒜在0.2，0.5和50 μg/kg加标水平下加标回收率范围分别为79.13%~91.32%，82.14%~94.15%和86.37%~106.28%，相对标准偏差（SRSD）分别为5.96%，5.53%和8.76%。胡椒在0.2，0.5和50 μg/kg加标水平下加标回收率范围分别为80.28%~92.66%，86.24%~98.45%和90.15%~109.45%，相对标准偏差（SRSD）分别为6.16%，4.62%和9.20%。小葱在0.2，0.5和100 μg/kg的加标水平加标回收率范围分别为76.88%~99.56%，78.04%~87.49%和89.57%~107.24%，相对标准偏差（SRSD）分别为9.22%，4.94%和7.86%。干辣椒在0.2，0.5和200 μg/kg的加标水平加标回收率范围分别为87.66%~107.68%，79.48%~89.47%和86.79%~105.46%，相对标准偏差（SRSD）分别为7.08%，5.20%和8.12%。结果均满足GB/T 27404—2008规定的被测组分含量＜100 μg/kg，回收率在60%~120%，被测组分含量100~1 000 μg/kg，回收率在80%~110%，精密度（相对标准偏差）≤11%的要求。