牛肝菌对动物肠道微生物的影响

刘晓雪，奚楚瑜，李文杰，张苒娇，田洋, ，宋爽,

1.云南农业大学食品科学技术学院（昆明 650201）；2.国家辣木加工技术研发专业中心（昆明 650201）；3.云南省生物大数据重点实验室（昆明 650201）

牛肝菌多分布于云南，是牛肝菌科和松塔牛肝菌科等真菌的统称，其滋味鲜美，营养丰富，具有一定的食用价值和药用价值，同时也是一种世界性著名食用菌。由于其具有多种抗病的药用保健价值，众多学者逐渐由食用扩大转入到药用研究及药用开发研究[8-9,11]。

益生元（prebiotics）作为一类膳食补充剂，种类繁多，生产商品化的主要是一些有双歧因子功能的低聚糖[4]。同时其对双歧杆菌等益生菌有促进作用，研究表明益生元功效包括：非消化性和低热量；减轻便秘；调节肠内微生物菌群的平衡，增强免疫促进有益菌群（双歧杆菌等），抑制有害菌群（沙门菌等）[3]。

随着生活水平的提高，人们更注重健康饮食，在食品或饮料中添加可以促进双歧杆菌生长的低聚糖，刺激肠道内原有双歧杆菌和乳酸杆菌的生长繁殖，有助于增强自身免疫和机体健康[6]。该试验采用荧光定量PCR技术对食用牛肝菌的小鼠菌群进行分析，研究其对动物肠道微生物的益生作用及对益生菌群的影响作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

昆明鼠（湖南斯莱克实验动物有限公司）；益生元（合生元）；粪便DNA提取试剂盒（Solarbio公司）；实时荧光定量试剂盒（Takara，Code No.638319）；琼脂糖凝胶电泳槽（BIO-RAD公司）；1 mL注射器（浙江康德莱医疗器械股份有限公司）；灭菌水；dd水（Solarbio公司）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.2 仪器与设备

StepOnePlusTM实时荧光定量PCR仪（美国运用生物系统公司）；3K15高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；PowerPacTM Basic电泳仪（BIO-RAD）；BP121S电子天平（Stertorius公司）。

1.3 方法与步骤

1.3.1 试验动物分组及处理

试验小鼠随机分成3组，分别为阳性对照组（灌胃益生元溶剂）、试验组（灌胃牛肝菌粉末溶液），空白试验组（灌胃生理盐水）每组6只，试验期间各组小鼠每日灌胃0.4 mL样品，连续7 d，分别采取试验动物第1天和第5天试验动物的新鲜粪便于自封袋中，放于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 粪便细菌DNA的提取

根据诺唯赞DNA Extraction Kit（Prepackaged）试剂盒说明书提取粪便细菌中的DNA。

1.3.3 DNA浓度及纯度检测

制胶：称取1 g琼脂糖置于锥形瓶中，加100 mL 1×TAE溶液，加热至琼脂糖全部融化。

加样：将10 μL DNA样品与2 μL的Loading buffer混合，取10 μL加入小槽内，第一格用Marker作对照。

电泳：120 V 60 min，溴酚蓝移动到距离胶板下缘1 cm处时，停止电泳。

观察：在紫外灯下进行观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

1.3.4 标准菌模板DNA的制备

收集培养好的标准菌新鲜菌体，使用DNA提取试剂盒提取DNA，且DNA产物应保存在-20 ℃，以防止DNA的降解。

1.3.5 PCR引物的设计

参考文献设计引物序列[1,15]，如表1所示，Real-time PCR法采用的引物序列、退火温度、扩增片段大小。

表1 引物序列名称

1.3.6 SYBR Green实时荧光定量PCR的建立

将提取好的DNA按照SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR试验[5]。

按照反应体系将配好试剂的8排管按照设计好的顺序平整放置于实时PCR仪中。根据程序完成PCR反应，于2 h后观察试验结果。

1.3.7 标准曲线的制作

收集培养好的标准菌新鲜菌体，采用相同的方法试剂盒提取DNA，将得到的DNA样品用无菌TE稀释10倍，用紫外分光光度计测定A260nm，计算DNA浓度，并根据每种细菌基因组大小计算相应模板数，以标准品模板数的对数为横坐标，PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数（Ct）为纵坐标即可做标准曲线。

1.3.8 待测粪便样品

将粪便样品中提取的DNA分别进行2种细菌的DNA荧光定量PCR反应，反应体系和条件与标准曲线制备时完全相同。反应完毕后根据熔解曲线分析PCR产物的特异性。

1.4 数据处理

每个试验重复3次，试验结果用均数±标准差表示。数据结果采用Excel 2007软件进行分析，带入Graphpad prism5软件进行绘制柱形图和分析显著性差异。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

其拷贝数=（6.023×1023×DNA浓度）/（660×碱基对数），计算出每微升的拷贝（见表2、表3），稀释为5个浓度梯度其拷贝数的对数值作为横坐标，PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数（Ct）的平均值为纵坐标即可做标准曲线。

表2 双歧杆菌标准曲线数据

表3 乳酸杆菌标准曲线数据

双歧杆菌、乳杆菌的标准曲线如图1和图2所示。结果显示：双歧杆菌标准曲线方程为y=-2.59x+43.996，相关系数R2=0.988 1；乳杆菌的标准曲线方程为y=-3.1x+39.048，相关系数R2=0.978 6。

图1 双歧杆菌标准曲线

图2 乳酸杆菌标准曲线

2.2 引物特异性检测

扩增曲线是PCR动态过程中的曲线，呈S型。其中，对数期是荧光信号指数扩增的阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。其用于表示不同拷贝数的模板循环数与荧光强度的关系，分为基线期、对数期及平台期3个阶段。通过实时荧光定量进行实时监测可得到标准品DNA扩增图和样品熔解曲线见图3~图6。

图3 双歧杆菌DNA样品定量PCR扩增图

图4 双歧杆菌DNA样品定量PCR扩增熔解曲线

图5 乳杆菌DNA样品定量PCR扩增图

图6 乳酸杆菌DNA样品定量PCR扩增熔解曲线

从PCR扩增熔解曲线中可以看出，乳酸杆菌只有1个峰值说明其引物的特异性良好，而双歧杆菌出现2个峰值说明其特异性不是很好，存在原因可能是引物浓度太大[12]。从扩增图可看出，DNA模板随着循环数增加，其荧光强度不断增，在PCR扩增图中找到相对应的样品的Ct值并取三者的平均数，如表4和表5所示。

表4 引物乳酸杆菌未知样品Ct值

表5 引物双歧杆菌未知样品Ct值

通过将未知样品的Ct值带入到相应标准曲线中对未知样品进行比对，如表6和表7所示。阳性对照组（益生元试验组）的对数转换后的拷贝数高于试验组及空白对照组，且第5天的样品的拷贝数高于第1天样品的拷贝数，就试验组的拷贝数而言，其第5天的数据同样高于第1天样品的拷贝数，说明小白鼠在灌胃前后肠道内的微生物发生一定变化，通过连续灌胃牛肝菌使得体内乳酸杆菌和双歧杆菌的数量增多，通过与空白试验组进行对照，进一步说明牛肝菌的益生作用，其对动物肠道内的有益微生物具有一定促进作用。

表6 乳酸杆菌的拷贝数

表7 双歧杆菌的拷贝数

3 结论与讨论

牛肝菌由于其食味香甜可口，营养丰富，是一种世界性著名食用菌。牛肝菌越来越受到重视，其具有极高的经济效益和社会效益，而试验结果也为野生菌开发研究提供一定参考。

实时荧光定量PCR检测是一种能够和特异性的双链DNA结合的荧光染料，在反应过程中，随着PCR产物增加，PCR产物与SYBR Green结合的量也随之增大[13]，二者结合后形成的荧光信号可被仪器检测到，通过对已知拷贝数的不同稀释倍数的阳性模板做荧光定量PCR，可做标准曲线，未知样品通过与标准曲线比较即可得出定性及定量结果。

为验证配制体系的试剂是否污染可以设定一个无模板的阴性对照做进一步验证。所以在试验前应进行大量预试验确定最佳参数和工艺。