响应面法优化牛蒡根多酚的闪式提取工艺

张朋，丁朋，丁利，耿影，付婷伟 ，宁晓雅

1.徐州天益食品科技研究院有限公司（徐州 210009）；2.徐州工程学院食品（生物）工程学院（徐州 221111）；3.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，徐州工程学院（徐州 221111）

多酚类物质是植物的重要代谢产物，广泛存在于果蔬、谷物、豆类等植物组织中[1]。就植物自身而言，多酚类物质对其生长和繁殖会起到不可替代的作用[2]。现代研究表明，多酚类物质具有显著的自由基清除、防衰抗老、防辐射、抗癌、降糖、抑制脂质过氧化、防治心脑血管疾病等多重生理功效[3-6]。此外，多酚类物质作为天然的功能因子还可在食品加工过程中辅助形成特定食品的苦涩味、颜色、香气，是食品感官及营养质量的重要决定因素[7]。因此，植物源多酚类物质具有巨大的开发潜力和应用潜力。

牛蒡根是我国传统的具有较高药用价值和保健价值的药食用蔬菜[8]。牛蒡根富含膳食纤维、蛋白质、氨基酸、维生素、菊糖、牛蒡苷、多酚等成分[9-10]，具有提高机体免疫，防治糖尿病、性机能减退、便秘等功效，在治疗风湿、中风等方面效果明显[11-12]。牛蒡多酚是牛蒡的重要活性物质，现代研究显示牛蒡多酚作为牛蒡生物保健功能物质的地位[13]。因此开展牛蒡多酚类物质的检测、提取、分离纯化、功能验证等方面的系列研究对于牛蒡产业的发展具有现实意义。采用响应面法优化牛蒡根多酚闪式提取工艺条件，并探讨其体外抗氧化活性，为拓展牛蒡精深加工路径、实现牛蒡功能因子产业化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜带皮牛蒡干燥切片[天益食品（徐州）有限公司]；苯酚（国药集团化学试剂有限公司）；30%过氧化氢（H2O2，Aladdin公司）；芦丁、没食子酸、福林酚（上海叶源生物科技有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

闪式提取器ZBEH-50T（河南智晶生物科技发展有限公司）；L-550高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 牛蒡根预处理

使用粉碎机将牛蒡根干切片粉碎后过0.250 mm（60目）筛，牛蒡粉装于自封袋中于干燥器中保存，备用。

1.3.2 多酚含量的测定

1.3.2.1 标准曲线的绘制

准确称取0.010 0 g没食子酸标准品于烧杯中，用蒸馏水溶解后转入100 mL容量瓶中定容，得质量浓度为0.10 mg/mL的没食子酸标准品溶液。分别量取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 mL 0.10 mg/mL没食子酸标准品溶液于25 mL棕色容量瓶，加入10 mL蒸馏水，再加入1 mL福林酚，摇匀后加入10 mL 7%的Na2CO3溶液，摇匀后定容至25 mL，即得质量浓度分别为0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL的没食子酸溶液，于常温避光放置30 min，在波长765 nm处测定吸光度，以没食子酸溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2.2 多酚得率的计算（式1）

式中：C为多酚提取液质量浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为提取液体积，mL；M为牛蒡质量，mg。

1.3.3 牛蒡根中多酚的提取

1.3.3.1 提取温度对牛蒡多酚得率的影响

取适量牛蒡粉，按料液比1︰40 g/mL加入体积分数70%的乙醇，在提取电压100 V条件下，分别在50，60，70，80和90 ℃条件下用闪式提取器提取60 s，得到的提取液在4 000 r/min条件下离心15 min，使用1.3.2小节的方法计算多酚得率。

1.3.3.2 料液比对牛蒡多酚得率的影响

取适量牛蒡粉，分别按料液比1︰10，1︰20，1︰30，1︰40和1︰50 g/mL加入体积分数70%的乙醇，在提取电压100 V、提取温度70 ℃条件下，用闪式提取器提取60 s，得到的提取液在4 000 r/min条件下离心15 min，使用1.3.2小节的方法计算多酚得率。

1.3.3.3 提取时间对牛蒡多酚得率的影响

取适量牛蒡粉，按料液比1︰40 g/mL加入体积分数70%的乙醇，在提取电压100 V、提取温度70 ℃条件下，用闪式提取器分别提取50，60，70，80和90 s，得到的提取液在4 000 r/min 条件下离心15 min，使用1.3.2小节的方法计算多酚得率。

1.3.3.4 Box-Behnken试验设计及响应面分析

在单因素试验结果基础上，采用Box-Behnken设计方案，以提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）为考察因素，以牛蒡多酚得率为响应值，使用Design-Expert 8.06软件优化多酚提取工艺参数。因素水平见表1。

表1 试验因素及水平

2 结果与分析

2.1 多酚标准曲线的绘制

采用1.3.2.1的方法绘制多酚标准曲线，如图1所示。

图1 没食子酸标准曲线

标准曲线的回归方程为y=9.607 1x+0.105 4，相关系数R2=0.999，在没食子酸质量浓度0~0.07 mg/mL范围内，线性关系良好。

2.2 单因素对牛蒡多酚提取的影响

2.2.1 提取温度对牛蒡多酚提取的影响

在不同的提取温度下，牛蒡多酚的得率不同。考察不同提取温度对牛蒡多酚提取的影响，结果如图2所示。

图2 提取温度对牛蒡多酚得率的影响

结果表明，牛蒡多酚得率随着提取温度的升高而提高。提取温度80 ℃时，提取率达0.72%±0.04%，提取温度升高至90 ℃时，多酚提取率为0.75%±0.05%。2种温度条件下，多酚得率间未表现显著差异，因此确定牛蒡多酚的提取温度选择80 ℃。

2.2.2 料液比对牛蒡多酚提取的影响

采用1.3.3.2的方法探讨料液比对牛蒡多酚提取的影响。具体的结果如图3所示。

图3 料液比对牛蒡多酚得率的影响

结果表明，不同料液比会对多酚得率产生较明显影响。料液比1︰30 g/mL时，多酚得率达到0.57%，随着料液比继续增大，多酚得率反而骤然下降，说明料液比1︰30 g/mL可有效溶出牛蒡根中的多酚物质，因此选择1︰30 g/mL作为牛蒡多酚提取的最优料液比。

2.2.3 提取时间对牛蒡多酚提取的影响

提取时间对牛蒡多酚提取的影响结果如图4所示。

图4 提取时间对牛蒡多酚得率的影响

结果显示，提取时间70 s内多酚得率随着提取时间的延长而显著升高，提取时间70~90 s内，多酚得率趋于平缓，数值上未有显著变化。因此确定70 s为牛蒡多酚闪式提取的最佳提取时间。

2.3 响应面法优化牛蒡多酚提取工艺

2.3.1 回归模型的建立及显著性检验

以牛蒡多酚得率为响应值，采用Box-Behnken设计方案优化牛蒡根中多酚的提取工艺。试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。利用Design Expert 8.06软件对表2中数据进行分析，得到响应值对自变量的回归方程：Y=0.75+0.082A-0.028B-0.047C+0.034AB-0.036AC+0.031BC-0.054A2-0.049B2-0.072C2。

表2 Box-Behnken响应面设计及其结果

表3 方差分析表

由方差分析结果可知，该回归模型极显著（P＜0.01），失拟项（P=0.152 3）不显著，表明试验值与预测值显著相关（R2=0.986 3，Radj2=0.960 1），模型与试验拟合良好，该模型可以反映牛蒡多酚得率的预测及分析。由表3还可以发现自变量对响应值即多酚得率的影响程度，其影响大小排序依次为提取温度（A）＞提取时间（C）＞料液比（B），其中因素A对多酚得率影响极显著（P＜0.01），因素B、C和AC的交互作用对多酚得率的影响显著（P＜0.05）。

2.3.2 牛蒡多酚提取响应面分析与优化

两两因素间的交互作用对牛蒡多酚得率的影响如图5所示。图中曲面越陡，变量对多酚得率影响就会越大。影响因素提取温度和提取时间的交互作用显著影响牛蒡多酚得率（P＜0.05），而提取温度与料液比、提取时间与料液比间的交互作用对得率的影响不显著（P＞0.05）。使用软件分析，牛蒡多酚的最优提取参数为提取温度83.70 ℃、料液比1∶30.15 g/mL、提取时间67.78 min，此条件下牛蒡多酚得率为0.777 8%。经全面综合考虑，修正提取参数：提取温度84 ℃、料液比1∶30 g/mL、提取时间68 min。经验证，此条件下多酚得率为0.779 3%。预测值与实际值间的相对偏差为-0.001 5，说明可以使用该模型预测牛蒡多酚的提取情况。

图5 两两因素交互作用对牛蒡多酚提取影响的响应面图

3 结论

在单因素试验基础上，以多酚得率为指标，采用响应面分析法优化牛蒡多酚闪式提取工艺。使用该方法建立的牛蒡多酚提取得率的预测模型为Y=0.75+0.082A-0.028B-0.047C+0.034AB-0.036AC+0.031BC-0.054A2-0.049B2-0.072C2。最优提取条件为提取温度84 ℃、料液比1∶30 g/mL、提取时间68 min。在该条件下牛蒡多酚得率达0.779 3%。试验对牛蒡多酚闪式提取工艺进行优化，获得的预测模型可有效预测牛蒡多酚的提取情况。闪式提取工艺的使用不仅可以避免传统提取方法可能带来的有效成分被破坏的弊端，还可有效提高活性成分的提取效率、缩短提取时间、减少提取溶剂使用量等，是活性成分提取的有效方法。牛蒡多酚闪式提取工艺的优化有助于开拓牛蒡产业发展路径，挖掘牛蒡资源的开发应用潜力，同时为天然功能因子的产业化提供思路与参考。