青光眼模型中线粒体自噬与视网膜神经节细胞损伤的关系

马海霞 胡欣欣 陆勤康

青光眼是以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，是导致不可逆性失明的主要原因[1]。视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells，RGCs）的进行性丢失是各类青光眼视神经损伤病理生理改变中的关键因素[2-3]。目前认为高眼压是青光眼主要的危险因素，也是目前临床上唯一可治疗的病因，然而即使给予确诊患者降眼压的治疗，仍不能阻止RGCs的死亡及其轴突的损害，一部分患眼视功能仍继续恶化[4]。保留RGCs的功能对于视觉信息传输到中枢神经系统而言至关重要，任何损伤导致眼与脑之间连接的改变都会对视觉产生严重影响[5]。因此，探究青光眼RGCs的死亡机制目前仍是青光眼领域的研究重点。

线粒体自噬是一种选择性自噬，通过自噬机制选择性清除受损线粒体或功能障碍线粒体，在维持线粒体稳态中起到重要作用[6]。已有研究表明线粒体自噬可促进帕金森病和阿尔茨海默症中神经元的存活[7]，提示线粒体自噬在神经退行性疾病的神经保护中起着重要作用。因此线粒体自噬在青光眼的发病机制中的作用也逐渐受到关注。现笔者将各类青光眼模型中线粒体自噬与RGCs的关系进行综述。

1 线粒体自噬

1.1 线粒体自噬的定义

线粒体参与体内多种重要的细胞过程，包括能量生成、代谢产物合成以及细胞凋亡的启动[8]。因此，维持体内线粒体稳态十分重要。线粒体自噬以选择性自噬的形式清除体内缺陷或功能障碍的线粒体，有助于维持线粒体质量和多种细胞类型中的线粒体数量控制的选择性降解机制[9]。研究表明线粒体自噬介导的线粒体清除在早期胚胎发育、细胞分化、炎症和凋亡等过程中发挥重要作用[6]。随着对线粒体自噬的深入研究，近年来研究者们发现，线粒体自噬功能障碍与神经退行性疾病、癌症、糖尿病等多种疾病的病理机制相关[10]。

1.2 线粒体自噬的机制

线粒体自噬通过特异性的线粒体外膜受体或与线粒体表面蛋白结合的泛素分子促进其在线粒体周围形成自噬体。在酵母中，线粒体外膜蛋白自噬相关基因32（Mitochondrial outer membrane protein autophagy-related gene 32，Atg32）与线粒体表面的Atg8和Atg11相互作用触发线粒体自噬机制。哺乳动物的线粒体自噬途径主要分为2 类：①受体介导途径：主要有BNIP3（Bcl-2/E1b19kDa-interacting protein 3）和NIX（Bcl-2/E1B19kDa-interacting protein3-like，又称BNIP3L）依赖性线粒体自噬以及FUNDC1（FUN14 domain containing 1）介导的线粒体自噬；②泛素介导途径：主要为PINK/Parkin介导的线粒体自噬[11]。本文主要介绍哺乳动物中的线粒体自噬机制。

1.2.1 受体介导的线粒体自噬 BNIP3、NIX/BNIP3L和FUNDC1 都具有LC3 结合基序（LC3-interacting region，LIR），起到自噬受体的作用，可直接结合LC3（哺乳动物Atg8同源物）激活线粒体自噬[12]。

BNIP3 与NIX是缺氧条件下线粒体高效周转所必需的。目前的研究表明在低氧条件下BNIP3表达上调并锚定在线粒体外膜（Outer mitochondrial membrane，OMM）上，促使线粒体通透性过渡孔开放、线粒体膜电位去极化以及招募LC3/GABARAPs形成自噬小体，从而诱导线粒体自噬的发生[13]。NIX与BNIP3具有56%同源性，NIX与缺氧诱导的肿瘤细胞凋亡、肥厚性心肌病以及红细胞发育有关[14]。FUNDC1是1种具有3个跨膜结构域的线粒体外膜蛋白，在线粒体解耦联、缺氧介导的线粒体自噬以及父系线粒体清除中起着线粒体自噬受体的作用[15]。在缺氧或线粒体跨膜电位下降时，线粒体磷酸酶增强FUNDC1与LC3的相互作用，从而促进线粒体自噬[16]。

1.2.2 泛素介导的线粒体自噬 PINK/Parkin依赖性线粒体自噬是由PINK1（PTEN-induced putative kinase 1）和Parkin（Parkin RBR E3ubiquitin protein ligase，PRKN，又称Parkin）介导的线粒体自噬途径。PINK1 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，表达于线粒体外膜，感知线粒体跨膜电位变化；Parkin是E3泛素连接酶，主要位于细胞质[17]。在线粒体受到损伤时，线粒体膜电位下降发生去极化，PINK1积聚在OMM上，导致已附着在OMM上的泛素分子磷酸化，进而促进Parkin由细胞质转位到线粒体，并触发其泛素连接酶活性，随后Parkin泛素化线粒体外膜蛋白，招募自噬受体蛋白，例如optineurin（OPTN）、P62以及自噬受体核点蛋白52（Nuclear dot protein 52，NDP52，又称CALCOCO2）结合于线粒体上，诱导下游自噬相关蛋白LC3 包裹线粒体形成自噬体，并通过溶酶体降解[18]。此外，Lazarou等[19]研究表明，parkin也可以独立于PINK1直接招募NPD52和optineurin蛋白到线粒体诱导线粒体自噬。

2 线粒体自噬与RGCs

2.1 RGCs的特殊代谢需求

视网膜是中枢神经系统的组成部分，被认为是哺乳动物代谢最活跃的部位之一。RGCs是视网膜唯一的传出神经元，RGCs轴突形成视神经并将视觉信息经视觉通路传递到大脑的高级视觉处理中枢[20]。RGCs轴突、郎飞结以及轴突末梢的无髓鞘区需要高密度的线粒体用以满足神经纤维传导和神经递质释放的高能量需求，因此RGCs容易受到氧化应激及线粒体功能障碍的影响[21]。

2.2 线粒体自噬参与RGCs发育与分化

越来越多的研究发现线粒体自噬对RGCs发育、分化过程起着至关重要的作用[22-23]，如Esteban-Martinez等[22]研究发现小鼠RGCs的分化及发育过程受线粒体自噬调节，实验观察到RGCs分化过程中线粒体数量减少而抑制线粒体自噬则减弱RGCs分化；在小鼠视网膜发育早期阶段，微管相关蛋白1A/1B轻链3（MAP1LC3/LC3）积累，基础自噬通量增强，线粒体自噬相关因子NIX、PINK及Parkin表达增加，RGCs自噬小体内观察到线粒体，且在溶酶体降解功能受到抑制后，线粒体数量增加，提示RGCs发育过程中线粒体数量减少是由线粒体自噬介导。当组织发生缺氧时，BNIP3L/NIX表达增加影响RGCs正常发育过程[23]。由此可见，线粒体自噬是RGCs正常分化及发育过程中不可缺少的重要部分。

2.3 线粒体自噬与视神经退行性疾病

近年来研究发现视神经退行性疾病的发病过程中RGCs的损伤可能与线粒体自噬有关。遗传性线粒体缺陷与多种视神经疾病相关，包括Leber遗传性视神经病（Leber's hereditary optic neuropathy，LHON）以及常染色体显性视神经萎缩（Autosomal dominant optic atrophy，ADOA）。LHON以RGCs变性和无痛性中央视力丧失为特征，其中mtDNA点突变被认为与线粒体功能障碍直接相关[24]。研究发现携带LHON特异性mtDNA突变的细胞线粒体自噬显著受损，从而导致细胞死亡；而激活线粒体自噬可改善线粒体缺陷，从而提高携带mtDNA突变细胞的存活率[25]。ADOA是一种常见的遗传性视神经病变，研究发现大约75%的病例是由线粒体蛋白OPA1基因突变引起的[26]，主要影响RGCs其轴突退化导致视力障碍。研究发现OPA1突变或缺失导致小鼠和线虫的RGCs中存在不受调控的线粒体自噬[27]。通常，线粒体自噬与神经保护相关，然而不受调控的线粒体自噬会降低线粒体密度，最终导致神经元死亡[7]。上述研究表明，线粒体自噬的稳态在视神经退行性疾病中对于维持线粒体功能以及细胞活性的作用是不可忽视的。

3 青光眼模型中的RGCs与线粒体自噬

人类视网膜约有150万个RGCs，由于正常生理衰老，每年RGCs损失量约为0.4%，而在青光眼患者中每年损失可达4%[28]。因此，探寻视网膜神经元的潜在保护机制对青光眼的治疗具有重要意义。以往的研究发现，在青光眼视神经病变中，眼压升高导致RGCs轴突横切面增加，单位面积的视神经内线粒体数量减少，导致RGCs轴突损伤，由于RGCs轴突损伤先于RGCs死亡，也有研究者认为受损神经元的线粒体从视神经头的轴突脱出，并以溶酶体融合的方式被邻近胶质细胞降解。近年来的研究发现线粒体自噬参与青光眼中RGCs的损伤。

3.1 谷氨酸兴奋毒性模型

不断有研究者发现Parkin介导的线粒体自噬对于谷氨酸兴奋毒性细胞模型中的RGCs具有一定的保护作用。谷氨酸是视网膜中主要的兴奋性神经递质，主要由光感受器细胞、双极细胞和神经节细胞释放[29]。1957 年，Lucas和Newhouse首次观察到注射谷氨酸后视网膜内层出现显著的细胞丢失[30]，随着研究深入，谷氨酸兴奋毒性被认为是青光眼性视神经退行性变的重要病理生理机制之一。Hu等[31]研究发现，在谷氨酸兴奋毒性青光眼细胞模型中RGCs轴突中线粒体数量明显增加，线粒体膜电位去极化，线粒体自噬相关parkin和optineurin蛋白表达上调；而parkin过表达可以恢复谷氨酸兴奋毒性下RGC中线粒体膜电位水平，对RGCs具有保护作用；在N-甲基-D天冬氨酸（N-Methyl-Daspartic acid，NMDA）诱导的兴奋毒性青光眼模型中发现，过表达parkin可以促进线粒体自噬，减少RGCs凋亡。Dai等[32]研究发现，在谷氨酸兴奋毒性作用下，parkin过表达可上调RGCs中LC3-II/LC3-I比值和溶酶体标记物LAMP1水平，同样提示parkin过表达对RGCs具有保护作用。上述研究表明线粒体自噬对于谷氨酸兴奋毒性青光眼模型中在线粒体功能以及减少RGCs死亡等方面具有一定积极作用。

3.2 DBA/2J小鼠模型

近年来研究发现线粒体自噬功能障碍导致受损的线粒体不断累积，可能对RGCs活性具有一定影响。Kim等[33]在DBA/2J小鼠青光眼模型中发现眼压升高后活性氧（Reactive oxygen species，ROS）产生增加，氧化应激相关蛋白表达上调，DBA/2J小鼠的RGCs轴突和树突中线粒体形态异常，RGCs死亡数量增多，提示眼压升高后RGCs中受损线粒体数量增加可能影响RGCs的存活。Coughlin等[34]在DBA/2J小鼠继发性青光眼模型中发现，眼压升高后各年龄段的视神经中存在线粒体自噬功能障碍，具体表现为线粒体自噬体及线粒体数量均增加，而LAMP1表达下降，提示受损线粒体并没有被线粒体自噬体有效回收。以上研究表明受损线粒体积累会对RGCs活性产生一定影响，线粒体自噬途径缺陷可能引起青光眼神经退行性变。

3.3 UCP2敲除小鼠模型

研究发现UCP2 缺失的视网膜对青光眼的抵抗性与线粒体自噬相关。线粒体功能障碍可导致ROS水平增加，线粒体解偶联蛋白2（Mitochondrial uncoupling protein 2，UCP2）基因在多种组织中表达，UCP2降低电子传递链效率，增加能量消耗，减少ROS生成[35]。Hass和Barnstable[36]通过在UCP2 敲除小鼠的前房注射微珠建立青光眼模型，发现UCP2缺失的青光眼小鼠模型的视网膜氧化损伤明显减少，同时RGCs中的线粒体自噬增强，受损线粒体被及时清除，避免RGCs进一步损伤。

3.4 慢性高眼压SD大鼠模型

近年来的研究发现，调节parkin介导的线粒体自噬通路可能有助于慢性青光眼大鼠RGCs的保护。Dai等[32]通过角膜缘激光光凝小梁网建立慢性高眼压模型，发现眼压升高后视神经中受损线粒体及功能障碍线粒体数量增加，RGCs死亡数量增加，RGCs细胞中观察到大量的自噬体以及线粒体自噬体，同时LC3-II/LC3-I比例增加，LAMP1 表达水平下调，表明青光眼大鼠RGCs中存在线粒体自噬功能障碍。Hu等[31]在慢性高眼压模型的研究中发现OPA1 过表达可促进OPA1 和parkin表达，此外促使线粒体自噬增加，进而减少RGCs死亡。由此可见，parkin介导的线粒体自噬对慢性高眼压模型RGCs具有保护作用，然而目前相关研究报道甚少，其具体作用通路尚不明确。

3.5 急性高眼压模型

研究发现线粒体自噬在急性高眼压模型中可能通过降低氧化应激对RGCs起到保护作用。视神经挤压/切断（Optic nerve crush，ONC）是一种常见的青光眼模型，Rodriguez-Muela和Boya[37]发现在视神经损伤、青光眼和其他视神经疾病的情况下，清除受损线粒体对于防止ROS产生、细胞质和轴突损伤以及减少RGCs死亡至关重要。Rosignol等[38]通过视神经挤压构建小鼠青光眼模型，利用mito-QC报告分析发现视神经挤压损伤7 d后视网膜中RGCs数量明显减少，线粒体自噬明显增强，进一步研究发现线粒体自噬诱导物DFP对氧化应激的RGCs具有显著保护作用。因此，线粒体自噬对于急性高眼压模型RGCs的保护作用可能是通过增强线粒体自噬以清除受损线粒体以及减少氧化应激实现的，但目前相关研究较少，仍需更多的研究以进一步明确。

4 小结

综上所述，RGCs是将视觉信息从视网膜传输到大脑的重要神经元，如何减少青光眼患者RGCs死亡是青光眼诊疗的关键。目前研究发现在不同类型的实验性青光眼模型中的RGCs存在线粒体自噬功能障碍。近年来对线粒体自噬在视神经病变中的研究取得显著进展，大量数据表明，调控线粒体自噬通路可保护RGCs。然而，目前线粒体自噬在青光眼发生发展中的具体信号通路及调控机制的认识仍处于初级阶段，随着线粒体自噬在青光眼中的深入研究，线粒体自噬有望成为青光眼等视神经退行性疾病的治疗靶点并提供新的治疗方案以减缓其进展。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明马海霞：收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。胡欣欣：参与选题、设计、资料的分析和解释，修改论文中关键性结果、结论，根据编辑部的修改意见进行核修。陆勤康：参与选题、设计和修改论文的结果、结论