HPLC 法测定益真健脑丸中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量*

谢海龙，董晏含，赵 波，何嘉郡

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，黑龙江 虎林 158400）

西洋参中含有多种化学成分，包括皂苷类、聚乙炔类、有机酸类等成分，其中主要活性成分是人参皂苷类成分[1]，现代研究表明人参皂苷类成分有抗氧化、抗肿瘤、抗心肌缺血、降血糖、降血脂的功效[2-5]。药典中记载的西洋参主要标志性成分为人参皂苷Rg1、Re、Rb1。本实验制备了经典方剂益真健脑丸，用于治诸虚不足，五劳七伤，面色无光，饮食无味[6]。

本文应用高效液相色谱（HPLC）对益真健脑丸中西洋参药材3 种主要成分人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量进行测定，为益真健脑丸的质量控制研究奠定基础。

1 实验部分

1.1 药品、试剂与仪器

人参皂苷Rg1标准品（B21057）、人参皂苷Re 标准品（B21055）、人参皂苷Rb1标准品（B21050），源叶生物；益真健脑丸（实验室自制）；甲醇（DIKMA 公司）、乙腈（DIKMA 公司）、H3PO4（科密欧化学试剂有限公司），以上为色谱纯。

BT25S 型电子分析天平（德国Sartorius 公司）；KQ5200DB 型数控超声波清洗器（永泰超声仪器有限公司）；A2010 型岛津液相色谱仪（日本岛津公司）。

1.2 3 种人参皂苷分析方法的建立

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil GOLD（C18柱，250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～25min，19%→20%A；25~60min，20%→40%A；60~90min，40%→55%A；90~100min，55%→60%A）；检测波长203nm；流速1.0mL·min-1；柱温40℃。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品2.00、4.00、10.00mg，用色谱级甲醇溶液定容至10mL 容量瓶内，摇匀，作为混合对照品溶液。溶液内含人参皂苷Rg10.20mg·mL-1、人参皂苷Re 0.40mg·mL-1、人参皂苷Rb11.00mg·mL-1。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密称取3.50g 药丸，约含0.50g 西洋参，加70%乙醇煎煮两次，每次3h，煎液过滤，合并滤液，浓缩得2.50g 浸膏，加入适量色谱级甲醇溶液使其溶解，再用色谱级甲醇溶液定容于10mL 容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 专属性

使用0.22μm 滤膜过滤空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，按照“1.2.1”的色谱条件进行分析，结果见图1。

图1 人参总皂苷高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatogram of total ginsenosides

由图1 可见，人参皂苷Rg1、Re、Rb1的保留时间分别约为27.5、28.7、52.4min，且对照品、供试品的峰形较好，证明方法的专属性好。

2.2 线性关系

取“1.2.2”项下混合对照品溶液，用0.22μm 滤膜过滤，取续滤液按照“1.2.1”的色谱方法进样分析，分别进样10、20、40、60、80、100μL，记录峰面积。分别以人参皂苷Rg1、Re、Rb1浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到人参皂苷Rg1标准曲线方程为y=3.7168x+3.6412（R2=0.9998）、人参皂苷Re 标准曲线方程为y=0.4396x+14.955（R2=0.9997）、人参皂苷Rb1标准曲线方程为y=2923x+8.5532（R2=0.9993）。标准曲线见图2。

图2 HPLC 法测定3 种人参皂苷的标准曲线Fig.2 Standard curve for the determination of three ginsenoside by HPLC

由图2 可见，人参皂苷Rg1、Re、Rb1分别在2.00~20.00、4.00~40.00、10.00~100.00 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.3 方法的精密度

取“1.2.2”项下制备的对照品溶液，按照“1.2.1”的色谱条件连续进样6 次，进样体积10μL，记录峰面积，计算人参皂苷Rg1、Re 和Rb1浓度的RSD，3种人参皂苷浓度的RSD 值结果见表1。

表1 3 种人参皂苷精密度结果Tab.1 Precision results of three ginsenosides

2.4 方法的稳定性

取适量“1.2.3”项下制备的供试品溶液，按照“1.2.1”的色谱条件进样，进样体积10μL，分别在0、2、4、6、8 和12h 进样，记录峰面积，计算人参皂苷Rg1、Re 和Rb1的RSD 值 分 别 为1.32%、1.03%、1.15%，均小于2%。结果表明，人参皂苷Rg1、Re 和Rb1在12h 内稳定性良好。

2.5 加样回收率

取适量“1.2.3”项下制备的供试品溶液进样，测得含人参皂苷Rg10.1510mg·mL-1、人参皂苷Re 0.8103mg·mL-1、人参皂苷Rb11.3460mg·mL-1，取适量“1.2.3”项下制备的供试品溶液6 份，每份1mL，置于5 mL 容量瓶中，各加入“1.2.2”项下混合对照品溶液1mL，加甲醇溶液超声稀释至刻度，摇匀，按照“1.2.1”的色谱条件进样，进样体积10μL，记录峰面积，计算加样回收率。结果见表2~4。

表2 人参皂苷Rg1 回收率测定结果Tab.2 Result of determination of recovery rate of ginsenoside Rg1

表3 人参皂苷Re 回收率测定结果Tab.3 Result of determination of recovery rate of ginsenoside Re

表4 人参皂苷Rb1 回收率测定结果Tab.4 Result of determination of recovery rate of ginsenoside Rb1

加样回收率=（人参皂苷Rg1/Re/Rb1测得量－样品中人参皂苷Rg1/Re/Rb1的含量）/人参皂苷Rg1/Re/Rb1对照品加入量×100%

由表2~4 结果可见，平均回收率的范围在80%~120%之间，且RSD 值小于2%，符合方法学考察要求。

2.6 益真健脑丸中3 种人参皂苷含量测定

取3 份益真健脑丸，按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“1.2.1”项下条件进样分析，进样体积10μL，通过峰面积值计算3 种人参皂苷的含量，结果见表5。

表5 益真健脑丸中3 种人参皂苷含量的测定结果（mg·g-1）Tab.5 Determination results of three ginsenosides in Yizhen Jiannao Pills

由表5 可见，益真健脑丸中人参皂苷Rg1含量为0.43mg·g-1；人参皂苷Re 含量为2.17mg·g-1；人参皂苷Rb1含量为3.85mg·g-1。按照原方剂配伍比例折算为每1g 西洋参药材中人参皂苷Rg1含量3.03mg·g-1；人参皂苷Re 含量为16.20mg·g-1；人参皂苷Rb1含量为26.93mg·g-1。合计西洋参中3 种人参皂苷总含量为4.6%，符合《中国药典》（2020 版）记载的西洋参项下含量测定标准，表明益真健脑丸原料中的西洋参药材为合格品。

3 结论

本文采用HPLC 法建立了益真健脑丸中3 种人参皂苷的含量测定方法，并进行了系统的方法学考察。结果表明，人参皂苷Rg1、Re 和Rb1在其浓度范围内线性关系良好，方法学考察各项结果均符合要求，准确度高，重现性好。综上，本实验为益真健脑丸的后续研究提供理论支持。