海带配子体低温冷冻保存研究

钱瑞，陈书秀，罗世菊，武瑞娜，王利芹，赛珊

（山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻与海参技术创新中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台 264003）

大型海藻种质保存技术，按照保存温度可以分2 大类：传统的低温弱光保存（一般为8～12 ℃）和以低温（4 ℃）、冷冻（-40 ℃）、低温真空冷冻干燥和超低温（-196 ℃）为主的冷冻保存[1]。关于海带种质保存方式，0～10 ℃低温弱光液体保存配子体，是公认的长期保存海带种质的最佳方式，目前我国的海带种质绝大多数是以这种方式保存。但该保存方式存在明显的不足，如保存期间，需定期更换培养液，工作量大、操作频繁，增加了种质污染及混杂的概率，同时限制了保存的规模和效率，保种过程中易出现细胞形态异常、单性生殖等现象[2-3]。-196 ℃液氮冷冻保存，可使配子体的代谢完全停止，实现配子体的永久保存，但液氮冷冻保存3 种常用方法（程序降温法、逐级冷冻法、包埋脱水法）均存在很大局限性，其中程序降温法对仪器设备要求高，包埋脱水法对脱水速率等操作要求极高，且3 种方法均需在液氮中进行，保存次数及保存量大受限制，后续保存成本极高[4-8]。

普通低温冷冻保存，相对于超低温冷冻保存更方便可行。罗世菊等[9]发明了一种海带配子体低温冷冻保存方法，将海带配子体加入预冷的10%DMSO 保护液（0 ℃）中，直接放入-80 ℃低温冰箱冷冻，可保存5～10 年。文献[1]研究发现，-40 ℃低温，即可抑制生物细胞的生化活动，排除遗传性状的变异，可用于多数海藻种质保存。现采用不同的温度（-80 ℃、-40 ℃、-20 ℃），对不同品种的海带配子体细胞段或细胞簇进行低温冷冻保存，比较不同温度对海带配子体生长发育的影响，以期为海带低温冷冻保存提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

设置3 个不同的温度组A（-80 ℃）、B（-40 ℃）、C（-20 ℃）和1 个对照组D（未冻存配子体细胞），对不同品种的海带配子体细胞段或细胞簇进行低温冷冻保存，15 d 后取出，进行复苏培养和发育培养，统计配子体细胞存活率及发育率。

1.2 材料

采用实验室低温弱光保存的雌雄配子体单克隆系，品种为901、东方6 号、东方7 号。保存条件为：温度10 ℃，光强10 μmol/m2·s，光时24 h/d。用于低温冷冻的配子体细胞为仅含2～5 个细胞的片段或多细胞簇。

1.2.1 仅含2～5 个细胞片段的获取方法

选取色素正常、状态良好、无污染的配子体材料，玻片压磨后，经孔径为0.048 mm 筛绢过滤，获得配子体细胞悬浊液，其中大多数为含有2～5 个细胞的小型片段。将一定量的悬浊液平铺于培养皿中，培养皿提前放置一定大小的玻片，玻片的大小以冻存管口径为标准确定。培养皿放置在10 ℃、10 μmol/m2·s 条件下恢复培养1 周后，附着于小玻片上的细胞段，用于低温冷冻。

1.2.2 多细胞簇的获取方法

选取低温弱光条件下保存的呈簇状的配子体克隆团，称取鲜质量0.010 g，放入冻存管直接冻存。

1.3 试验方法

1.3.1 冷冻保护液配制

采用煮沸冷却的海水为基础液，配制10%体积浓度的二甲基亚砜冷冻保护液，置于0～4 ℃冰箱存放，备用。

1.3.2 冻存方法

所有冻存管分别加入1 mL 冷冻保护液并编号，放入-20 ℃冰柜预冻24 h。后取出，再分别加入1.3.1 中的10%DMSO 保护液0.8 mL。用镊子夹取1.2.1 和1.2.2 中获得的不同细胞状态的配子体材料，分别放入不同编号的冻存管中，拧紧盖子。所有冻存管放入0～4 ℃低温冷藏箱平衡30 min。平衡结束，将处理好的配子体材料分别放入-80，-40，-20 ℃低温冻存。

1.3.3 解冻和保护剂的去除

将冻存15 d 的冻存管放入40 ℃的恒温水浴锅中，迅速震荡直至最后一个冰晶消失，用镊子将附有配子体细胞段的小玻片或多细胞簇取出，分别放入培养皿或锥形瓶中，加预冷低温培养液，多次换水冲洗，去除冷冻保护剂。

1.3.4 存活率的测定

将经过冷冻保护处理解冻后的配子体细胞，接种于新鲜培养基中，附有细胞段的玻片接种于培养皿中，细胞簇接种于100 mL 锥形瓶中。均放置在10 ℃、光强10 μmol/m·2s、光时24 h/d 条件下培养。

细胞段存活率的计算：冷冻保存之前每个玻片随机观察10 个100×视野，统计每个视野中的总细胞段数，求平均值作为冻存总细胞段数。解冻复苏后，每周镜检观察配子体生长状态，第30 天，每个玻片上随机观察10 个100×视野，统计每个视野中的存活细胞段数，求平均值，即每个试验条件共测量30 个数据（n=30）。计算公式如下：

细胞段存活率（%）=存活细胞段数/冻存总细胞段数×100%。

细胞簇存活率的计算：解冻复苏后7 d，每个锥形瓶中的配子体细胞簇，用移液枪吸取微量的海带配子体于载玻片上，用牙签将丝状体尽量分开，在载玻片上滴1～2 滴海水，用镊子盖上盖玻片后，用吸水纸吸干周围多余的水分，即制作好配子体样本。将样本在显微镜下观察，并用数码相机记录配子体的生长状态。采用Image J 进行数据测量，测量每个视野（100×）中细胞总面积与存活细胞总面积，每个配子体样品测量10 个数据，即每个试验条件共测量30 个数据（n=30）。存活率计算公式：

细胞簇成活率（%）=存活细胞面积/细胞总面积×100%。

1.3.5 冻存的海带配子体发育试验

将冻存复苏后培养6 个月的同品种雌、雄配子体，分别磨碎后经孔径为0.048 mm 筛绢过滤，形成一定浓度的细胞悬浊液，相同密度的雌雄配子体按照体积比2∶1 混合均匀。取适量的雌雄混合悬浊液平铺于培养皿中，放置在光照强度20 μmol/m2·s 、光周期10L∶14D、温度10 ℃条件下培养。每3～4 d更换1 次培养液并镜检，观察其生长发育情况，试验周期30 d。

配子体发育率的计算：每个培养皿随机观察10 个100×视野，分别统计卵囊形成、排卵、幼孢子体和总细胞数，按卵囊形成数、排卵数和孢子体数之和占总细胞数的百分比计算发育率。

1.4 数据处理

用SPSS19.0 软件对存活率及发育率进行单因子方差分析、多重比较，P＜0.05，表示差异显著。用Excel 转件作图。

2 结果与分析

2.1 不同冻存温度对海带配子体细胞段存活率及细胞恢复生长的影响

不同冻存温度、品种、性别对海带配子体细胞段存活率的影响结果方差分析见表1。由表1 可见，不同冻存温度、海带品种及雌雄差异对海带配子体细胞段存活率有显著的影响（P＜0.05），但其中两者或3 者的交互作用对海带配子体细胞段存活率无显著影响（P＞0.05）。

表1 不同冻存温度、品种、性别对海带配子体细胞段存活率的影响结果方差分析

不同冻存温度、品种和雌雄差异对配子体细胞段存活率的影响见图1（a）（b）。由图1 可见，3 个品种的海带雌配子体细胞段经3 种低温冻存后的存活率无显著差异，存活率均低于10%。901 海带雄配子体细胞段在-80 ℃、-40 ℃冻存后的存活率（24.73%、17.87%）显著高于东方6 号和东方7 号雄配子体细胞段的存活率。3 个海带品种雌雄配子体细胞段在经-20℃冻存后的存活率（0.03%～2.60%），均低于A 组和B 组（1.30%～24.73%），但其中仅901不同温度冻存组间细胞段的存活率差异显著，东6和东7 海带不同温度冻存组间细胞段存活率差异不显著。经相同低温冷冻的3 个海带品种雄配子体细胞段存活率（0.33%～24.73%）均高于雌配子体（0.03%～6.77%）。

图1 不同冻存温度、品种和雌雄差异对配子体细胞段存活率的影响

对冷冻复苏培养后的存活细胞段镜检发现，复苏初期配子体细胞段会出现大量死亡，经30 d 培养后，存活细胞段颜色加深，开始出现分支，培养75 d后，每个存活细胞段均长成了具有大量分支的细胞簇状体，且经不同冷冻处理的海带配子体生长状态无显著差异。见图2（a）（b）（c）。

图2 不同温度冻存的901♂配子体细胞段

2.2 不同冻存温度对海带配子体细胞簇存活率及细胞恢复生长的影响

不同冻存温度、品种、性别对海带配子体细胞簇存活率的影响结果方差分析见表2。由表2 可见，不同冻存温度及雌雄差异对海带配子体细胞段存活率有显著的影响（P＜0.05），但品种、两者或三者的交互作用对海带配子体细胞段存活率无显著影响（P＞0.05）。

表2 不同冻存温度、品种、性别对海带配子体细胞簇存活率的影响结果方差分析

不同冻存温度对3 个品种的海带雌雄配子体细胞簇存活率的影响见图3（a）（b），由图3 可见，3 个品种的海带雌雄配子体细胞簇经-20 ℃冻存后的存活率（0.44%～1.37%）显著低于A 组和B 组的存活率（32.00%～43.38%）。经相同低温冻存的雌雄配子体存活率相比较，雄配子体细胞簇存活率高于雌配子体，但差异不显著（P＞0.05）。

图3 不同冻存温度、品种和雌雄差异对配子体细胞簇存活率的影响

对冷冻复苏培养后的存活细胞簇镜检观察发现，复苏初期配子体细胞簇会出现部分死亡，经7 d培养后，细胞簇的部分丝状体分支舒展，细胞颜色明显加深，细胞内色素分布均匀，见图4（a）（b）（c）。经过90 d 的培养和观察，确定处于该状态的细胞即可判定为存活细胞，且经不同低温冷冻后存活的海带配子体细胞簇的总细胞量差异显著，但存活细胞的生长状态无显著差异，见图4（d）（e）（f）。

图4 不同温度冻存的901♀配子体细胞簇复苏培养后的细胞状态

2.3 不同冻存温度对海带配子体细胞发育能力的影响

从2.1 和2.2 分析结果可以看出，-20 ℃低温冷冻保存的海带配子体复苏后的成活率极低，因此本试验选用-80 ℃和-40 ℃低温冷冻保存的材料进行发育试验。经不同温度冷冻后的配子体均可正常发育，且各组间的发育率无显著差异（P＞0.05）。在发育过程中，随着发育时间增加，各组间的发育率显著增加，发育进程及最终发育率无显著差异。第28 天的发育率均在70%左右，小苗率占40%～50%。与未经冷冻保存配子体相比较，其发育进程和发育率均无显著差异，见表3。

表3 不同冻存温度对海带配子体发育的影响 %

3 讨论

许多大型海藻如红藻中的紫菜属、江篱属，褐藻中的海带属、马尾属、裙带菜属等，不仅是工业原料和食品，同时也是海洋生态环境修护的工具藻种，具有重要的经济和生态价值。因此需要重视海藻资源的保护，其中一项有效的措施就是海藻种质保存，这些种质不仅可以为科学研究提供材料，也是退化海藻场修复和养殖业持续健康发展的基石[10]。根据海藻种质的生理状态，可将种质保存方法分为培养保存和低温保存2 类。

培养保存的原理是种质在特定条件下会不断地营养生长而不发育，达到长期保存的目的，如果要使用，不需要复杂的复活过程[11]。培养保存方式主要包括低温弱光和固定化。方宗熙[12]最早发明了利用低温弱光保存海带和裙带菜无性繁殖系的方法，该方法保存的配子体大部分具有正常的活力，恢复正常温度光照后，可正常发育产生孢子体。王欢等[13]将条斑紫菜（P. yezoensis）丝状体包埋后置于4 ℃暗光下保存，其成活率可达71%，且能保持正常生长能力。邹定辉等[14]研究发现，羊栖菜处于干出状态（避免失水）的生殖托，在5 ℃可保存30 d，其细胞相对活力及配子体释放能力较好。王志勇等[15]研究表明，坛紫菜叶状体细胞，可以在半固态至固态琼脂培养基上良好地存活、分裂和再生。陈昌生等[16]发现坛紫菜在10 ℃固体平板上可长期保存。本实验室于20 世纪70 年代建立了海带配子体的采集和培养技术[17-20]，随之建立了以低温弱光液体保存[21-25]为主的海带种质库，海带种质库建立之初保存的种质材料，最长时间可达20 年之久，每年均选择部分配子体进行扩大培养和育苗，生长速率及发育能力与新采集的种质间无显著差异。为了克服低温弱光液体保存方法所存在的工作量大等缺陷，2005 年山东东方海洋科技股份有限公司和烟台大学合作开发了海带配子体固相保存技术[26]，并经后期多次优化，建立了一种种质无菌采集与固相培养相结合的保存方法[27]，此方法从源头就抑制细菌污染，简化了常规固相保存前期的无菌处理流程，保存过程中使克隆进入休眠状态，延长保存时间。

低温保存，即冷藏和超低温，在此温度下，种质基本停止了新陈代谢活动，在重新培养时，需要进行复杂的复活过程。陈昌生等[16]使用胶囊化法，在-20 ℃低温保存坛紫菜的丝状体，其成活率＞80%。郭金耀等[28]用包埋法使条斑紫菜脱水后，-20 ℃保存的种质成活率可达70%。陈素文等[29]将海萝（G.furcata）风干至其鲜质量的1/4，于-80 ℃保存，其孢子附着率达70%。罗世菊等[9]将海带配子体加入预冷的10% DMSO 保护液（0 ℃）中，直接放入-80 ℃低温冰箱冷冻保存，雌配子体存活率＞50%左右，雄配子体存活率＞60%左右，可保存5～10 年。

本试验结果表明，将配子体细胞簇加入至预冷后的10% DMSO（0 ℃）中，直接放于-80 ℃或-40 ℃冷冻保存，经复苏培养后测得的配子体成活率达40%左右，而经同样方法冷冻保存后的细胞段存活率仅在10%左右，因此处于细胞簇状态的配子体细胞更适合用于-80 ℃或-40 ℃冷冻保存。若将经冷冻保护液处理过的种质材料，于-20 ℃冷冻保存，有部分品种未见存活配子体细胞，存活的海带品种配子体成活率均＜3%。

4 结论

设置3 个不同的温度组A（-80 ℃）、B（-40 ℃）、C（-20 ℃）和1 个对照组D（未冻存配子体细胞），对不同品种的海带配子体细胞段或细胞簇进行低温冷冻保存，15 d 后取出，在适宜条件下发育培养了6 个月。结果表明，经不同温度冷冻后的配子体，均可正常发育，与未经冷冻保存配子体相比较，其发育进程和发育率均无显著差异。由此可见，经10%DMSO 处理的配子体细胞簇，可以直接放于-80 ℃或-40 ℃进行冷冻保存，但此方法的适用海带品种范围及保存年限还需进一步验证。