新型冠状病毒奥密克戎变异株无症状感染者新冠病毒全基因组测序分析#

周建松*吴若禹 简洁 蒋家俊李莎 李婉宜 周琳琳△

（1.贵阳市疾病预防控制中心检验科，贵州 贵阳 550000；2.四川大学华西基础医学与法医学院病原生物学系，四川 成都 610000）

新型冠状病毒（Sever acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，以下简称“新冠病毒”）属于冠状病毒科β属冠状病毒属，是迄今为止被发现的冠状病毒中第7种可以使人类致病的冠状病毒，其全基因组包含近30000个核苷酸碱基，由14个蛋白编码区域构成[1]。自从2020年初2019冠状病毒病 (COVID-19) 大流行开始以来，全世界已出现了一系列新冠病毒的变异株。2021年11月24日，南非首次向WHO报告了奥密克戎变异株感染病例，该变异株较其它变异株突变位点更多，且有更强的传染性和免疫逃逸能力，在短时间内迅速传播至全球多个国家和地区[2,3]。之后，奥密克戎变异株BA.1亚型迅速取代其他变异株成为优势流行毒株，并在全球多个国家和地区传播，对公共卫生构成了明显威胁。2021年底，在丹麦、南非和印度等国的感染患者中发现了奥密克戎的另一谱系BA.2[4]。

2022年2 月开始，我国多地出现新冠病毒奥密克戎变异株引起的COVID-19疫情[5,6]。与其他新型冠状病毒变异株相比，奥密克戎变异株引起重症疾病的概率较低，症状以发烧、头痛、流鼻涕、喉咙痛等为主，但是奥密克戎变异株的传播性更强[3]。SARS-CoV-2在流行传播过程中，不断出现传播能力增强、抗体有效性降低及免疫逃避的新毒株，未来也将可能出现新的变异株，将高通量测序技术应用到新冠病毒感染的疫情防控当中，从基因组水平上了解病毒的分子学特征，对疫情防控及准确的研判具有重要意义[7]。

本研究对贵阳市2022年9月一起由奥密克戎变异株引起的疫情中的6例无症状感染者鼻咽拭子样本进行新型冠状病毒全基因组测序分析，为了解奥密克戎变异株的流行特征和进化变异特点提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

2022年8月31 日，贵阳市在风险职业人群定期监测中发现1例新冠病毒核酸检测结果异常，截止9月29日24时，该轮疫情累计报告确诊病例230例，无症状感染者1543例。本研究收集到该轮疫情中6例本土新型冠状病毒无症状感染者，采集鼻咽拭子样本，并收集相关流行病学资料。

1.2 核酸提取与新型冠状病毒核酸检测

采用核酸提取及纯化试剂盒（上海伯杰，磁珠法），取样本200μl于对应孔内，使用全自动磁珠核酸提取仪（上海伯杰）进行核酸提取。利用新冠病毒核酸检测试剂（上海伯杰）对所获得的核酸进行新型冠状病毒逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测。

1.3 全基因组文库构建和测定

以提取的病毒 RNA 作为模板，使用ULSEN超高灵敏度新冠病毒全基因组捕获试剂盒（低载量）（北京微未来）、Nextera XT Library Preparation Kit（Illumina，美国）、Nextera XT Index Kit（Illumina，美国）进行文库构建。（1）使用ULSEN超高灵敏度新冠病毒全基因组捕获试剂盒（低载量）（北京微未来）对新型冠状病毒进行逆转录及全基因组扩增，再对扩增产物进行浓缩、纯化；（2）使用Nextera XT Library Preparation Kit（Illumina，美国）和Nextera XT Index Kit（Illumina，美国）进行双链DNA片段化和文库构建、纯化及均一化；（3）采用Illumina Miseq 二代测序系统、Micro Miseq芯片及配套试剂（Illumina，美国）对构建的文库进行全基因组测序。

1.4 全基因组序列拼接与比对

以NCBI数据库中的新型冠状病毒 Wuhan-Hu-1（NCBI Reference Sequence：NC_045512.2）基因组作为参考序列，使用MicronCoV Analyzer分析软件（北京微未来科技有限公司）进行新型冠状病毒全基因组序列拼接及核苷酸变异位点检测。应用Pangolin（https://pangolin.cog-uk.io/）和Nextclade（https://clades.neststrain.org/）在线分析平台，判定病毒谱系及型别，分析病毒的变异位点。

2 结果

2.1 样本信息及核酸检测结果

由于该轮疫情传播链条较为复杂，不能确认感染源，存在多条传播链，初步流行病学调查结果显示6例新型冠状病毒无症状感染者之间不存在直接流行病学关联。

6例感染者中，男2例，女4例；年龄最小10岁，最大68岁；在此次感染时，4例接种过新冠疫苗接种（均接种2剂及以上），2例未接种过新冠疫苗。经新型冠状病毒核酸检测，6份样本Ct值均小于30，详情见表1。

表1 新冠病毒奥密克戎变异株无症状感染者样本信息

表2 基因组测序基本情况

2.2 基因组测序基本情况

本研究共获得6条覆盖度大于99%的新型冠状病毒全基因组序列，测序数据质控合格，满足分析要求，Nextclade分型结果显示，6条均属于21L型（Omicron）。Pangolin分型结果显示（pangolin version：v 4.2），6条21L型（Omicron均属于BA.2.76。

2.3 核苷酸及氨基酸变异分析

与新型冠状病毒武汉株（NC_045512.2）相比，感染者1和4的新型冠状病毒全基因组序列存在相同的76个核苷酸变异，分别为ORF1ab区25个（T670G，C1108T，C2790T，C3037T，G4184A，C4321T，C7528T，A9055G，C9344T，A9424G，C9534，C9866T，C10029T，C10198T，G10447A，C10449A，C12880T，C14408T，C15714T，C17410T，A18163G，G19009T，G19684T，C19955T，A20055G），S区30个（C21618T，G21987A，T22200G，T22304A，G22578A，G22599C，C22674T，T22679C，C22686T，A22688G，G22775A，A22786C，G22813T，T22882G，G22992A，C22995A，A23013C，A23040G，A23055G，A23063T，T23075C，A23403G，C23525T，T23599G，C23604A，C23854A，G23948T，A24424T，T24469A，C25000T），ORF3a区4个（C25416T，C25418A，C25584T，C26060T），E区1个（C26270T），M 区3个（C26577G，G26709A，C26858T），ORF6 区4个（A27259C，G27382C，A27383T，T27384C），ORF7区1个（C27807T），ORF8区1个（C27972T），N区5个（C28311T，G28881A，G28882A，G28883C，A29510C），非编码区2个（C241T，A28271T）。

感染者2的新型冠状病毒全基因组序列存在78个核苷酸变异，与感染者1、4的序列相比增加了2个突变位点（C44T、C7843T）。感染者3的新型冠状病毒全基因组序列存在77个核苷酸变异，与感染者1、4的序列相比增加了1个突变位点（G26140T）。感染者5的新型冠状病毒全基因组序列存在78个核苷酸变异，与感染者1、4的序列相比增加了2个突变位点（C44T、G25996T）；感染者6的新型冠状病毒全基因组序列存在77个核苷酸变异，与感染者1、4的序列相比增加了1个突变位点（C1122T）。

与新型冠状病毒武汉株（NC_045512.2）相比，感染者1、2、4的氨基酸变异位点为56个且完全相同，分别为E：T9I，M：Q19E、A63T，N：P13L、R203K、G204R、S413R，ORF1a：S135R、T842I、G1307S、L3027F、T3090I、L3201F、T3255I、P3395H，ORF1b：P314L、R1315C、I1566V、D1848Y、V2073L、T2163I，ORF3a：T9K、T223I，ORF6：D61L，ORF8：Q27，ORF9b：P10S，S：T19I、A27S、G142D、V213G、Y248N、G339D、R346T、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K。

感染者3的氨基酸变异位点为57个，与感染者1相比增加了1个突变位点（ORF3a: D250Y），感染者5的氨基酸变异位点为57个，与感染者1相比增加了1个突变位点（ORF3a:V202L），感染者6的氨基酸变异位点为57个，与感染者1相比增加了1个突变位点（ORF1a: P286L），详见表3。

表3 位点变异情况

3 讨论

新型冠状病毒经过在全球不同人群间突变进化与新冠疫苗选择压力的双重选择下，已演变出多种不同的亚型或分支，包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron及现目前主要流行的XBB系列变异株等[8,9]。截至目前，奥密克戎变异株是基因组突变数量最多的VOC（(Variants of concern，VOC)）。突变影响了其生物学特性，包括增强了病毒的复制能力和与宿主细胞受体的亲和力，导致奥密克戎变异株具有更强的传播性[4]。2021年11月11日，奥密克戎（BA.1）变异株首次在博茨瓦纳被发现，随后在丹麦、南非和印度等国的感染患者中发现了奥密克戎的另一谱系BA.2。研究表明，BA.2变异株的传染性比BA.1变异株高30%，但不会引起更严重的疾病[10]。BA.2.76变异株属于BA.2的第三个亚变体，于2022年7月首先由捷克报告，后续传入印度、缅甸等多个国家，在我国四川、西藏、重庆等多地也引起了多起疫情[11]。由于本轮疫情传播链复杂，且存在多条传播链同时传播的情况，无法通过分子溯源分析证实其是否存在流行病学关联。通过在全球新冠病毒数据库GISAID中比对，发现本研究中6例样本与同时期国内西藏、青海、四川病毒序列高度同源。本研究6例样本均来自无症状感染者，因无同时期其他病例新冠病毒全基因组测序结果进行比对，无法判断无症状感染者样本中BA.2.76变异株与有症状感染者样本中BA.2.76变异株的变异区别，后续可进行深入研究。

2023年5月5 日，世界卫生组织宣布，新冠疫情不再构成“国际关注的突发公共卫生事件”，然而结束“国际关注的突发公共卫生事件”并不意味着新冠疫情的结束，也并不意味着疫情危害就彻底没有。随着新冠病毒的不断传播及变异，仍需继续做好新冠病毒的变异情况和疫情发生发展情况的监测，做好预警和风险的研判工作，保障群众健康。