UPLC测定不同产地茯苓中5种三萜类成分的含量*

2023-07-27张丽君

广州化工 2023年8期

张丽君，王凯，刘鸣，雷丽，高波，谭沛，高巍，3

(1 安徽华润金蟾药业股份有限公司，安徽淮北 235000；2 华润三九医药股份有限公司，广东深圳 518110；3 华润三九(六安)中药材产业发展有限公司，安徽六安 237000；4 华润三九现代中药制药有限公司，广东惠州 516000)

茯苓是我国大宗常用菌类药材，已有二千多年应用历史，具有利水渗湿，健脾宁心的功效[1-2]，广泛用于临床配方。茯苓在我国广有分布，但经年采收，野生资源已稀存，药材主要依靠栽培提供，且不同产地栽培的茯苓药材存在一定的差异。2020版《中国药典》茯苓项下未制定含量测定项，不能对茯苓质量进行全面控制。以往文献研究显示，多糖和三萜类化合物为茯苓的主要化学成分为[3-4]。根据国内外报道，茯苓菌丝体和菌核中分离到的三萜类化合物多属于四环三萜类，且主要为羊毛甾型四环三萜[5]。本实验主要采用UPLC法，对茯苓中5种三萜类成分去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、松苓新酸[6-12]同时测定，以期对茯苓药材不同产地[13-14]的质量评价提供一定的参考。

1 仪器与试药

Thermo Vanquish超高效液相色谱仪，赛默飞科技有限公司；KQ-800 DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；XPE 26、MS204S电子天平，METTLER TOLEDO公司。

12批茯苓药材分别从湖南、湖北、云南、安徽4个主产区收集，经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核、去氢土莫酸对照品(批号：170112-202012，纯度98.0%)、猪苓酸C对照品(批号：260087-202107，纯度96.0%)、松苓新酸对照品(批号：190166-202009，纯度98.0%)，上海鸿永生物科技有限公司；去氢茯苓酸对照品(批号：21060701，纯度99.5%)，成都格力普生物科技有限公司；3-表去氢土莫酸对照品(批号：020177-202107，纯度96.0%)，中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；水为娃哈哈水；其它试剂均为分析纯。

表1 茯苓样品来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：HSS T3-C18(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(78∶22)；柱温：25 ℃；流速：0.3 mL/min；检测波长：243 nm；进样量：2 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、松苓新酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL中含去氢土莫酸25 μg、猪苓酸C 12.5 μg、3-表去氢土莫酸7.5 μg、去氢茯苓酸15 μg、松苓新酸5 μg的混合溶液，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定茯苓药材粉末(过三号筛)约1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10 mL，称定重量，超声提取30 min，放至室温，再称定重量，用甲醇补足损失的重量，滤过，即得。

UPLC色谱图见图1。

图1 茯苓UPLC

2.4 线性范围考察

精密称定5种三萜类指标成分对照品适量，加甲醇制成每1 mL中含去氢土莫酸0.1947 mg、猪苓酸C 0.0964 mg、3-表去氢土莫酸0.0548 mg、去氢茯苓酸0.1145 mg、松苓新酸0.0368 mg的混合对照品母液，精密吸取母液5 mL加甲醇定容至10 mL，依次等比稀释，得到7份系列浓度的混合对照品溶液，进样测定并记录相应峰面积。将峰面积做为纵坐标Y，将对照品进样量(μg)做为横坐标X，并进行线性回归，结果见表2。

表2 线性回归关系结果

2.5 供试品精密度试验

对同一份茯苓药材粉末(批号201004)精密称定，按供试品制备方法处理，同一供试品溶液连续进样6次，测定各指标成分的峰面积，结果5种三萜类指标成分的峰面积RSD均<2%，说明该方法仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

对同一批茯苓药材粉末(批号201004)精密称定，按供试品制备方法处理，并进样测定，根据各指标成分峰面积计算含量质量分数的RSD，结果去氢土莫酸RSD为0.92%；猪苓酸CRSD为0.99%；3-表去氢土莫酸RSD为1.01%；去氢茯苓酸RSD为0.98%；松苓新酸RSD为0.92%，表明该方法具有良好的重复性。

2.7 稳定性试验

对同一份茯苓药材粉末(批号201004)精密称定，按供试品制备方法处理，并分别在第0，2，4，6，8，10，12 h进样测定，并计算各指标成分的峰面积RSD，结果去氢土莫酸RSD为0.10%；猪苓酸CRSD为0.09%；3-表去氢土莫酸RSD为0.19%；去氢茯苓酸RSD为0.19%；松苓新酸RSD为1.86%，表明供试品溶液在12 h内(样品盘25 ℃)稳定，可以满足测定需要。

2.8 加样回收率试验

对同一批已知含量的茯苓药材粉末(批号201004)6份(未扣水分去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、去氢茯苓酸、松苓新酸的含量分别为0.29、0.12、0.08、0.17、0.05 mg/g)精密称定，每份约0.5 g，另用甲醇配制每1 mL中含去氢土莫酸140 μg、猪苓酸C 65 μg、3-表去氢土莫酸42 μg、去氢茯苓酸87 μg、松苓新酸28 μg的混合对照品溶液，精密加入1 mL该混合对照品溶液至每份供试品样品中，再按2.3项下制备方法处理样品，并对含量进行测定，结果表明该方法回收率良好。计算结果见表3～表7。

表3 去氢土莫酸加样回收率

表4 猪苓酸C加样回收率

表5 3-表去氢土莫酸加样回收率

表6 去氢茯苓酸加样回收率

表7 松苓新酸加样回收率

2.9 样品测定

分别对12批不同产地的茯苓药材样品，按确定的供试品制备方法和色谱条件测定，5种三萜类成分的含量见表8。

表8 5种成分含量测定结果

3 讨论

3.1 波长的选择

对去氢土莫酸等五种三萜类成分在190～400 nm下进行3D图谱全波长扫描，结果在波长为243 nm时五种三萜类目标成分均呈现出最大吸收，故最终确定茯苓药材样品的检测波长为243 nm。

3.2 流动相的选择

分别考察了乙腈-水，甲醇-水，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.1%磷酸四种不同流动相，结果显示当流动相为乙腈-0.1%磷酸时，5种三萜类目标成分出峰时间较短，峰形、分离度等系统适应性参数也较好。

3.3 提取方法的选择

对供试品提取方法进行考察时，主要研究了超声和回流两种不同提取方法的差异，结果显示，当提取方法为超声时，5种三萜类目标成分色谱峰峰面积均高于回流提取，且超声在实际实验操作中更简便，故最终选择提取方法为超声；并进一步对不同提取溶剂(水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇)进行考察，对比试验数据结果发现，甲醇的提取效果更加充分完全；在此基础上，比较了甲醇超声不同提取时间(15 min、30 min、45 min)的差别，结果超声30 min、45 min各色谱峰峰面积基本无变化，故确定30 min为最终超声提取时间；进而考察了甲醇提取溶剂用量5 mL、10 mL、20 mL的提取效果，结果三者差异不大，考虑到操作性，最终选择提取溶剂用量为10 mL。