川芎嗪-延胡索乙素凝胶贴膏的制备及评价

黄慧敏,陈惠娴,钟玉环,宋煜*,吴水生*

(1.福建中医药大学药学院,福建 福州 350122;2.福建中医药大学中西医结合学院,福建 福州 350122)

多味中药配伍使得中药方剂具有多组分、多靶点等综合优势,但同时也导致其药效物质基础及配伍机制的研究庞杂[1]。组分中药是以传统中医药理论为指导,遵循方剂配伍原则,由有效组分配伍而成的现代中药,是将中药引入现代药物制剂方法和技术的一种新手段[2]。组分配伍的建立与完善,可将中药配伍复杂的体系简单化,可促进组分中药制剂向更为有效、安全、质量可控的方向发展[3]。本课题以经典药对“川芎-延胡索”的主要成分为研究对象[4-5],其中,川芎能够活血行气、祛风止痛;延胡索具有行气、活血、止痛之效;二者相须为用,使活血止痛之效更佳。因此,本试验以组分配伍为指导思想,从单体成分相互作用层面出发,选取川芎中的川芎嗪、延胡索中的延胡索乙素进行制剂研发。

由现代药理学研究可知,川芎嗪对炎性疼痛、心绞痛、神经性疼痛等具有较好的疗效[6],但其口服制剂、注射剂等虽在体内吸收迅速,但半衰期较短,无法持续在体内释放[7];延胡索乙素具有抗肿瘤、镇痛、神经保护等多种药理活性,但其在体内稳定性较差[8],且不易溶于水[9],故将其二者制成凝胶贴膏。凝胶贴膏具有避免首过效应、控制药物释放率、与皮肤相容性好等优点[10]。本研究以初黏力、模拟汗液影响、感官评价的综合评分为指标,采用Plackett-Burman 设计、最陡爬坡试验、Central Composite Design 响应面法优化凝胶贴膏的基质处方,同时筛选其最佳促渗剂种类及用量,制备川芎嗪-延胡索乙素凝胶贴膏,为该剂型后续开发使用奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司);RYJ-12B药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器有限公司);DV215CD型十万分之一天平(美国OHAUS公司)。

1.2 试药 聚丙烯酸钠(NP-700,昭和电工株式会社,批号:240770A);甘羟铝(日本协和工业株式会社,批号:SG-0557);聚乙烯醇(PVA1788,批号:H1809081);卡波姆940(罗恩试剂公司,批号:R005294);羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司,批号:20151215);无水柠檬酸(阿拉丁生化科技有限公司,批号:K2110834);甘油(麦克林生化科技有限公司,批号:C11455088);氮酮(源叶生物,批号:J21GS152202);桉叶油(源叶生物,批号:B09N10C102404);丙二醇(麦克林生化科技有限公司,批号:C12517049);Transcutol P(麦克林生化科技有限公司,批号:C10606031)。川芎嗪、延胡索乙素(湖北帝柏公司,纯度≥98%)。

2 方法与结果

2.1 凝胶贴膏制备 A相:取处方量NP-700、CMC-Na、甘油混合;B相:取处方量卡波姆940、PVA在水中溶胀;C相:取处方量甘羟铝、无水柠檬酸加水溶解;D相:组方药物加乙醇溶解;先将B、C、D相混匀后,加入A相,同时加入促渗剂,搅拌均匀后立即涂布在7 cm×40 cm无纺布上,覆膜晾干后,裁成7 cm×10 cm大小即得。

2.2 评价指标建立

2.2.1 初黏力 根据滚球斜坡停止法[11],取“2.1”项下7 cm×10 cm大小的凝胶贴膏1片,揭开防黏层后膏面向上,固定于30°斜面上,取不同直径的钢球,从膏面自由滑落,测试3次,能粘住最大钢球直径为满分,其余以(粘住钢球直径测得值/最大钢球直径)×30计分。

2.2.2 模拟汗液 由于凝胶贴膏在体应用会接触到体温与汗液,尤以使用烤灯促进药物吸收时,易导致膏剂出现变黏、拉丝、滞留皮肤等现象。因此本研究特设模拟人体温度及汗液对膏体的影响作为考察因素。将凝胶贴膏撕开防黏层贴在光滑的不锈钢钢面上,加入1 mL的生理盐水,置于45 ℃烘箱,并于每贴背衬上压重物,12 h后撕开进行评分,以20分为基准;不拉丝,不黏腻,不残留在钢板上为15～20分,拉丝、黏腻,但不残留在钢面上为9～14分,拉丝、黏腻且残留在钢面上0～9分。

2.2.3 感官评价 参考文献[12-13],指标包括①外观,膏体均匀,气泡少为10分,以2分为一级,依次按0～10分计分;②残留情况,揭开覆膜无拉丝,手指轻触表面无残留为10分,2分为一级,依次按0～10分计分;③涂布性,根据涂布的难易程度分为5个等级,2分为一级,依次按0～10分计分;④渗布情况,根据无纺布渗出的轻重程度为5个等级,2分为一级,依次按0～10分计分;⑤皮肤追随性,将凝胶贴膏贴于手臂用力甩动,依据膏体甩动掉落的次数排序,由大到小按0～10分计分。

2.3 Plackett-Burman设计 根据临床用量结合单体成分在饮片中的含量,往每个处方中固定加入川芎嗪320 mg、延胡索乙素128 mg,采用Plackett-Burman 设计对其他因素进行安排,以“2.2”项下综合评分为指标,因素水平见表1,结果见表2。

表1 Plackett-Burman设计因素水平

表2 Plackett-Burman设计结果

通过Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行拟合,得到回归方程为综合评分=55.29+2.94A+4.25B+6.39C+7.92D-3.82E+2.77F-1.70G(r=0.939 1)。方差分析见表3,表明模型具有显著性(P<0.05);各因素影响程度依次为:D>C>B>E>A>F>G,其中NP-700、CMC-Na 用量有显著影响(P<0.05)。

表3 Plackett-Burman设计方差分析

2.4 最陡爬坡试验 通过最陡爬坡试验来进一步确定凝胶贴膏的处方水平范围。结果见表4,试验号4综合评分最高,故Central Composite Design 响应面法选择其作为因素中心点。

表4 最陡爬坡试验结果

2.5 Central Composite Design 响应面法 以“2.3”和“2.4”项下试验数据为基础,进一步采用Central Composite Design 响应面法进行优化,因素水平见表5,结果见表6。

表5 Central Composite Design 响应面法因素水平

表6 Central Composite Design 响应面法结果

通过Design-Expert 8.0.6软件对表6数据进行拟合,得到回归方程为综合评分=79.17+3.24A+3.23B+4.29AB-8.71A2-6.64B2+1.27A2B-7.45AB2(r= 0.978 3),方差分析见表7,模型显著(P=0.000 7),失拟项P=0.601 2>0.05,可用于预测;因素A、B、AB、A2、B2、AB2均为显著项(P<0.05)。响应面分析见图1,最终确定最加基质处方NP-700用量为14.00 g,CMC-Na用量0.4 g,综合评分为79.17。

图1 响应面图

表7 Central Composite Design 响应面法方差分析

2.6 验证试验 按最佳处方制备3批凝胶贴膏,进行验证试验。所得凝胶贴膏综合评分的平均值为79.33分,RSD为0.7278%,与预测值79.17分接近,表明该方法稳定可靠,预测性良好。

2.7 川芎嗪、延胡索乙素含量测定HPLC方法建立

2.7.1 色谱条件 色谱柱:SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);梯度洗脱(0～3 min,10% A;3～6 min,10% A→20% A;6～15 min,20% A→51% A;15～18 min,51% A→60% A;18～24 min,60% A→90% A;24～28 min,90% A→10% A;28～30 min,10% A);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:280 nm;柱温:35 ℃;进样量:20 μL。

2.7.2 制备混合对照品溶液 精密称取川芎嗪2.02 mg、延胡索乙素2.05 mg,分别置于5 mL量瓶中,用甲醇配制成0.404 mg·mL-1、0.410 mg·mL-1的母液;再吸取各样品母液2.5 mL于25 mL同一量瓶中,用20%甲醇定容至刻度,得川芎嗪浓度为40.4 μg·mL-1、延胡索乙素浓度为41.0 μg·mL-1混合对照品溶液。

2.7.3 制备供试品溶液 取经皮渗透药物溶液,经0.22 μm滤膜滤过,即得。

2.7.4 制备阴性样品溶液 取空白凝胶贴膏接收液,经0.22 μm滤膜滤过,即得。

2.7.5 专属性试验 将对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液按照“2.7.1”色谱条件下测定,见图2。结果显示此方法对两待测成分含量测定无干扰,专属性良好。

2.7.6 线性与范围 取“2.7.2”项下混合对照品溶液0.1、0.5、1、2.5、5、7.5 mL,置于10 mL容量瓶中,用20%甲醇稀释并定容至刻度,摇匀。取上述系列稀释溶液及混合对照品溶液,按“2.7.1”项下色谱条件测定,以质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,得回归方程分别为川芎嗪Y=37 457X+5 457.8,r=0.999 6;延胡索乙素Y=16 095X+5 553.1,r=0.999 3。结果表明,川芎嗪在0.404～40.0 μg·mL-1、延胡索乙素在0.401～40.1 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.7.7 溶液稳定性试验 取“2.7.3”项下供试品溶液,在“2.7.1”项色谱条件下于0、1、2、4、8、10、12和24 h进样测定,测得川芎嗪、延胡索乙素峰面积RSD分别为2.33%、1.83%,表明溶液在24 h内稳定。

2.7.8 精密度试验 取“2.7.2”项下对照品溶液,按“2.7.1”项下色谱条件连续进样6次。测得川芎嗪、延胡索乙素峰面积的RSD分别为1.09%、0.81%,表明仪器精密度良好。

2.7.9 回收率试验 在“2.7.4”项下的阴性样品溶液中分别加入混合对照品溶液,制成到高、中、低浓度后,按“2.7.1”项下色谱条件分别进样测定,测得川芎嗪、延胡索乙素平均回收率分别为99.06%、100.19%,RSD分别为0.62%、3.34%。

2.8 体外经皮渗透试验

2.8.1 离体皮肤的制备 将SD大鼠用20%乌拉坦(0.7 mL每100 g)麻醉后,用电动剃毛刀去除大鼠背部体毛,脱毛膏涂布皮肤2 min后用棉球擦去,处死,剥离背部皮肤并剔除皮下组织和脂肪等粘连物质,用生理盐水干净后,置-80 ℃冰箱中保存。

2.8.2 扩散试验 采用Franz扩散池法,将贴有凝胶贴膏的皮肤置于扩散池上、下两室间,向接受室中加满含30%乙醇的生理盐水溶液,确保供给室中的溶液不漏出后,用洗耳球轻敲以排气泡。设置恒温水浴温度为32 ℃,磁力搅拌速度为300 r·min-1。扩散面积为2.269 cm2,接受室体积为6.5 mL,开始计时,分别于2、4、6、8、12、24 h取样1 mL,同时补充相同条件下的补给液1 mL。将取出的接收液按照“2.7.1”中的色谱条件进行测定,并计算样品浓度。

2.8.4 促渗剂选择 根据前期文献调研,选择3%氮酮、氮酮+丙二醇=1∶1、桉叶油、transcutol P作为促渗剂种类进行筛选,经皮渗透曲线见图3。由表8～9可知,氮酮较其他促渗剂而言对川芎嗪和延胡索乙素都具有较好的促渗作用。因此以氮酮作为促渗剂,进一步筛选其用量。

图3 不同促渗剂对川芎嗪(A)、延胡索乙素(B)累计渗透量的影响(n=3)

表8 不同促渗剂对川芎嗪体外经皮渗透的影响(n=3)

表9 不同促渗剂对延胡索乙素体外经皮渗透的影响(n=3)

2.8.5 氮酮质量浓度分数选择 不同质量浓度分数氮酮的经皮渗透曲线见图4,对川芎嗪、延胡索乙素渗透特征的影响见表10～11。由表可知,通过促渗率比较,不同质量浓度分数氮酮对川芎嗪促渗作用大小为3%>5%>1%>2%>7%,对延胡索乙素为5%>3%>2%>1%>7%。结果表明,3%氮酮对川芎嗪的促渗效果最好,5%氮酮对延胡索乙素的促渗效果最好,且氮酮的促渗效果与其质量浓度分数呈非线性关系。由于3%与5%氮酮浓度对川芎嗪、延胡索乙素的经皮渗透速率差异不大,且24 h平均累计渗透量,均无显著性差异。因此,为降低促渗剂对膏体质量产生的影响,同时减少氮酮对皮肤刺激性,最终选择以3%氮酮作为促渗剂。

图4 不同质量浓度分数氮酮对川芎嗪(A)、延胡索乙素(B)累计渗透量的影响(n=3)

表10 不同质量浓度分数氮酮对川芎嗪体外经皮渗透的影响(n=3)

表11 不同质量浓度分数氮酮对延胡索乙素体外经皮渗透的影响(n=3)

3 讨论

通过预试验对评分指标进行考察,按现行国家药典要求还需要对贴剂进行持黏力与剥离强度的测定,但由于本试验这两个测定结果的差异性不大,故未作为正式试验的评分指标。选择模拟汗液影响作为评分指标,是在预试验中将凝胶贴膏贴于后背过夜,由于汗液和人体自身重量产生的压力与温度,使得贴膏变黏腻且残留在皮肤上,因此本研究特设模拟汗液影响作为评分标准对贴剂基质处方进行筛选。由于促渗剂的使用会对贴剂的性质产生一定影响,因此本试验在筛选空白基质时固定加入3%氮酮进行评价。同时,在前期试验中对膏体的厚度进行一定的筛选,选择以0.5、1、1.5和2 mm的厚度,经过模拟汗液影响的试验后,发现厚度为1 mm时膏体不易产生拉丝残留的现象且在感官评价中的评分较高,因此将膏体的涂布厚度设定为1 mm。

通常在透皮实验中为模拟人体内的释放环境而选择用生理盐水为接收介质[14],但由于延胡索乙素的水溶性较差,为满足漏槽条件,本研究选择使用30%乙醇-生理盐水溶液作为接收液介质。同时,通过透皮扩散实验可知,促渗剂用量与促渗效果并不是成正比的关系,因此以多成分指标筛选促渗剂用量时,应综合考虑膏体对促渗剂的容纳度,促渗剂对膏体残留情况的影响以及各成分发挥的作用,尤其以中药复方提取物为原料药时,可考虑从君臣佐使的角度进行权重分析,同时兼顾各成分的渗透速率、促渗率、累计渗透量、相关系数等[15]。根据沈腾等[16]研究,当川芎嗪透皮给药制剂面积为70 cm2时,透皮速率须到29.33 μg·(cm2·h)-1以上可达到治疗血药浓度,本试验以3%氮酮作为促渗剂时透皮速率为42.827 μg·(cm2·h)-1可满足其治疗要求,同时与延胡索乙素配伍使用,使其效果更佳。

中药复方体系的疗效是药物中的单体化合物共同协调发挥多靶点作用的结果[17]。因此,我们以“从复方中来到复方中去”为思路[18],从“川芎-延胡索”药对的诸多化合物中选择出单一的有效化合物成分,以川芎嗪、延胡索乙素为组分配伍制备凝胶贴膏。试验所制得凝胶贴膏具有明确的有效成分,制备简便,质量可控,为组分配伍所制中药剂型提供了现实意义和理论意义。