蠲毒消瘤饮抑制结肠癌细胞的作用机理

伊凡,林依娜,杨俊玲,汪慧,邓皖利,周铭心

(1.乌鲁木齐市中医医院,新疆 乌鲁木齐 830000;2.上海中医药大学附属普陀医院中医肿瘤科,上海 201203;3.新疆医科大学,新疆 乌鲁木齐 830000)

结肠癌(colorectal cancer,CRC)是现今全球最常见的恶性肿瘤之一,高居肿瘤相关死亡率排名前三。近些年来人们越来越重视消化内镜的检查,运用科技手段检测发现,CRC发病率呈阶梯式上升,且逐渐有年轻化发展的趋势。随着临床中对早期CRC的诊断和治疗手段的改进,在临床中起到了至关重要的作用使得结肠癌患者的生存率有着明显提高[1-3]。目前针对中晚期结肠癌患者行化疗方案,对于术前甚至术后患者均未达到预期满意疗效,故积极寻求探索新型化疗靶向药物对于改善结肠癌中晚期预后具有重大临床意义[4-9]。近年来,发现部分临床治疗趋向中西医结合,中医药的介入使得CRC的治疗途径得到了国内外广泛的关注,中药具有疗效显著、毒副作用小等特点,在临床治疗中起到重要作用。中医认为结肠癌属于“癥瘕”“肠覃”“脏毒”“下痢”等范畴,其病机早期多以实证为主,多见于气滞、血瘀等实邪为主,久病则虚致使元气亏虚终为病之根本,二者互为影响,搏结凝而为“岩”,发为肿瘤。常常由实而致积,因积而益虚,虚实夹杂形成恶性循环。通过查阅大量古籍文献和临床医学记录发现,中医药对于改善CRC具有一定的疗效,特别近些年的临床观察和探索,证实了中医药治疗CRC在缓解症状,提高生活质量,预防转移均具有一定疗效[10-13]。

本研究中药方剂蠲毒消瘤饮是由国家级名老中医刘继祖教授创制,刘教授从医六十余年,挖掘中医古籍并结合地方特色和癌病临床特点,总结出独具特色的倡癌毒学说,并综合历代医家治癌学说和理念,在此基础上提出其治疗大法以“健脾和胃”“益气培元”为辅来固护正气,其本质是使体内生理功能尽量恢复平衡稳定,消除或减轻有害物质的侵袭。查阅相关文献报道,中药联合化疗可以通过改善机体的免疫功能,增加机体造血功效,从而有效逆转肿瘤多重耐药,还可以更好地减轻或降低化疗药物所产生的不良反应,有效延长患者的存活期限。本课题以结肠癌 HCT116细胞株为实验对象,检测蠲毒消瘤饮对HCT116细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并初步探讨其作用机制,为临床治疗CRC提供可靠的理论依据与治疗思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 蠲毒消瘤饮(白花蛇舌草 30 g、半枝莲6 g、半边莲 6 g、夏枯草 10 g、浙贝母 10 g、 山慈菇 6 g、八月札 6 g、苦豆子 3 g、槐花 6 g、地榆 10 g、黄芪 30 g、太子参 10 g、白术 15 g、炙甘草 6 g等中药)由乌鲁木齐市中医医院制剂室提供。

1.1.2 试剂 人结肠癌HCT116细胞;细胞培养基(批号:L2240)、VEGF-CST蛋白(批号:66431-1-lg)、基底胶(批号:S350JV)、Ras抗体(批号:60236-1-lg)、发光液(批号:abs911)、甲醛(批号:30525-00-4)、结晶紫(批号:548-11-9),以上试剂均购自上海微界贸易发展有限公司;小牛血清(Thermo Fisher,批号:10100188);青链霉素混合液(Thermo Fisher,批号:15070123);MTT(生工生物,批号:310-90-1);DMSO(Sigma,批号:D1179);ERK 抗体(CST,批号:4600);Raf、Raf-1 抗体(Santa Cruz,批号:sc-7463);p-MEK1/2(CST,批号:146F8);MEK1/2(CST,批号:9142);Transwell 小室(BD,批号:345297);Annexin V/PI 检测试剂盒(BBI LifeScience,批号:E606336-0167)。

1.1.3 仪器 FACS Calibur流式细胞仪(BD Bioscience);DYCZ-25E电泳仪(北京六一生物科技有限公司);DYCZ-40G转膜仪(北京六一生物科技有限公司);XDS-1倒置显微镜(重庆光学仪器厂);RT-6100酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人结肠癌HCT116细胞为贴壁细胞,采用含10%新生牛血清、1%青链霉素混合液培养于37 ℃、5%CO2饱和湿度下常规培养传代,将处于对数生长期的细胞用来试验。

1.2.2 MTT试验检测细胞增殖情况 培养后的细胞生长到对数生长期后,以5 000 cells/well的密接种于96孔板培养板中,用培养基稀释中药蠲毒消瘤饮原液后处理细胞(2、5、10、20、40、和80 μg·mL-1)加入对应的孔中。细胞继续培养至48 h后,每孔分别缓慢滴加MTT溶液,再缓慢滴加100 μL DMSO溶解MTT的还原产物,震动混匀数秒,用酶标仪检测,计算肿瘤细胞的存活率,利用软件计算细胞的IC50。

1.2.3 划痕试验检测细胞迁移情况 将不同浓度的HCT116细胞培养48 h后接种于6孔板。镜下观察细胞划痕,并用Leica QwinV3软件测量划痕距离,根据划痕距离计算细胞的迁移率。

1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭情况 用无血清培养基将Matrigel以1∶3比例进行稀释,混匀后铺于Transwell小室上层。分别加入0、2、5 μg·mL-1蠲毒消瘤饮其基底已铺胶的 Transwell 小室内,培养箱中培养 24 h。接下来用4%甲醛固定细胞,进行结晶紫染色,室温放置15 min后用蒸馏水脱色,镜下观察并计数穿过Matrigel膜的细胞数量。

1.2.5 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡 将HCT116细胞计数,以每孔2×105cell/well的密度接种于6孔板,设定蠲毒消瘤饮浓度(0、2、5 μg·mL-1),分别加入对应的孔板中,药物处理48 h,收集细胞,PBS重悬清洗细胞并进行PI染色,充分混匀后,上机检测药物作用后细胞凋亡的改变。按照流式细胞仪检测4个象限代表的意义分别为左下象限:正常活细胞群;右下象限:处于早期凋亡的细胞群;右上象限:处于晚期凋亡的细胞群;左上象限:坏死的细胞群。

1.2.6 Western blot试验 采用Western blot 试验检测VEGF、MEK1/2、ERK1、Ras/Raf以及Raf-1表达水平变化。在 0、2、5 μg·mL-1蠲毒消瘤饮作用48 h后,采用细胞总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白,采用Bradford法检测蛋白含量。随后陆续进行电泳、转膜等试验方法进行显影和定影。

2 实验结果

2.1 蠲毒消瘤饮在体外抑制HCT116细胞增殖 MTT结果显示蠲毒消瘤饮作用HCT116细胞48 h后,各浓度组对细胞增殖均有抑制作用,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05),并且蠲毒消瘤饮对细胞增殖的抑制作用呈显著的剂量依赖性,根据抑制率计算药物作用后的IC50值为23.18(见图1A)。体外实验检测蠲毒消瘤饮对结肠癌HCT116细胞自噬水平的影响,按照试验要求对HCT116蛋白进行免疫荧光检测,结果显示表达量随着蠲毒消瘤饮药物剂量的增加而降低(见图1B)。说明蠲毒消瘤饮能够有效抑制HCT116细胞的增殖,并且存在药物剂量的影响,药物浓度越大抑制效果越明显。

A.MTT检测蠲毒消瘤饮对HCT16细胞增殖的影响;B.体外实验检测蠲毒消瘤饮对结肠癌细胞HCT116自噬水平的影响图1 MTT实验检测蠲毒消瘤对结肠癌HCT116细胞增殖的影响

2.2 蠲毒消瘤饮抑制结肠癌HCT116细胞的迁移和侵袭 划痕实验的结果显示,蠲毒消瘤饮作用 HCT116细胞48 h后,能够抑制细胞的迁移。随着药物浓度的增加,抑制细胞迁移作用增强(见图2A)。Transwell实验结果显示,蠲毒消瘤饮作用结肠癌细胞48 h后,能有效抑制细胞的侵袭。随着药物浓度的增加,穿过 Matrigel 凝胶到达小室下层的细胞数逐渐减少,对侵袭作用的抑制能力逐渐增强(见图2B)。

A.划痕实验结果定量(与0 μg·mL-1比较,△P<0.01,▲P<0.001);B.Transwell实验结果定量图2 蠲毒消瘤饮对结肠癌HCT116细胞迁移和侵袭能力的影响

2.3 Annexin V/PI双染法检测蠲毒消瘤饮诱导HCT116细胞凋亡 Annexin V/PI 双染法结果显示,当蠲毒消瘤饮作用HCT116细胞48 h后,活细胞数目百分比降低;凋亡细胞数目百分比升高,说明蠲毒消瘤对 HCT116 细胞具有凋亡诱导作用,并且该诱导作用具有浓度依赖性(见图3)。

A:流式检测蠲毒消瘤饮对结肠癌细胞HCT116细胞凋亡的影响;B:流式数据定量结果(与0 μg·mL-1比较,△P<0.01,▲P<0.001)图3 蠲毒消瘤饮对结肠癌HCT116细胞凋亡的影响

2.4 Western blot法检测蠲毒消瘤饮调控VEGF信号通路表达 当蠲毒消瘤饮作用 HCT116 细胞48 h后,经Western blot法检测细胞中VEGF、MEK1/2、ERK1、Ras/Raf以及Raf-1 表达水平变化。结果显示,蠲毒消瘤饮能升高细胞中VEGF表达(见图4B),能降低细胞中 p-MEK1/2、p-ERK1、Ras/Raf以及Raf-1表达(见图4A)。

A.WB检测蠲毒消瘤饮对结肠癌HCT116细胞VEGF信号通路相关蛋白的影响;B.WB检测数VEGF信号通路相关蛋白据定量结果(与空白对照组比较,△P<0.01,▲P<0.001)图4 蠲毒消瘤饮对结肠癌细胞HCT116细胞凋亡的影响

3 讨论

祖国传统医学在治疗肿瘤疾病的过程中发挥着举足轻重的作用,其治疗癌症拥有丰富的临床实践经验,相关研究报道,中医药在抑制肿瘤增殖方面也占据关键地位。中医治疗寻求辨证论治的思维体系,将发病机体作为一个整体为出发点,故而治疗手段宜扶正与祛邪作为主线贯穿始终。纵观现代医学将放疗与化疗作为中晚期CRC的主要治疗手段,其本质是对肿瘤细胞产生抑制作用,直击病灶主要以祛邪为主。其与中医的治疗思路有着本质区别,中医治病与传统讲究中和、中庸,即不偏不倚,无太过与不及,治疗宜正邪兼顾,攻补兼施,实乃顾全大局。根据机体情况进行辩证治疗其虚宜补之,实宜泻之,其病机多以实证为主,治疗宜攻宜泻;久病则虚致使元气亏虚,治疗宜缓宜补。不仅兼顾了患者因病致虚予以补益,同时也对病所进行攻伐,虚实相兼[14-16]。根据实验内容,查阅相关文献发现中医药抗肿瘤的研究报道越来越多,也侧面反映出中医药在治疗肿瘤中极具特色,现代医学机制与中医理论相结合,从现代研究中阐述中医药抗肿瘤的作用机理,对于肿瘤的防治思路拓展有着重大意义[17-18]。中医认为该病病因病机早期多以实证为主,多见于气滞、血瘀、热毒、痰湿等实邪为病机;发病时间期限过长,因病致虚导致元气亏虚乃病之根本,二者互为影响,最终致使毒火内蕴,经络瘀阻,津液失布致使血行停滞,聚而为瘀,积而成形最终附着于脏腑,导致气血失行,渐使精微耗损,大肉渐脱,形容枯槁,终至气损,久病极虚,机体日益虚衰,阴阳离决,故癌毒治疗上,非重剂猛攻则毒不得散、其结不得解、非急去其邪则正不能复。常常由虚而致积,因积而益虚,形成恶性循环。据此研制了蠲毒消瘤饮,处方由白花蛇舌草、半枝莲、半边莲、夏枯草、浙贝母、山慈菇、八月札、苦豆子、槐花、地榆、黄芪、太子参、白术、炙甘草等组成,配伍及治则治法符合中医辨证规律,诸药合用方可共奏健脾和胃、益气培元之效。该方以太子参、黄芪联用以健脾益气、大补元阳二者共为君药;白术、八月札合用可奏健脾燥湿、醒脾开胃之能,与补益药合用以防滋腻碍胃,二者是为臣药共奏健脾益气,复生中气之效;使用白花蛇舌草、半枝莲、半边莲、夏枯草、山慈菇等联用是以攻毒消瘤、消瘀散结之用,而苦豆子是新疆地区盛产的特色药材,具有清热利湿、解毒祛瘀之功效,浙贝母、槐花、地榆联用可以清热凉血、消瘀散结之功,以上诸药共为佐药;予以炙甘草,用以益气健脾是为使药;纵观全方攻补兼备,按照中医君臣佐使的理念配伍而成,从中医角度来说固护后天之本,方可更好地改善结肠癌患者基础代谢,使患者可以带瘤生存,提高结肠癌患者的生存质量和远期疗效[19]。

本次实验研究发现,蠲毒消瘤饮抗肿瘤的作用机理十分突出,MTT结果显示蠲毒消瘤饮作用HCT116细胞,各浓度组对细胞增殖均有抑制作用;并且蠲毒消瘤饮对细胞增殖的抑制作用呈显著的剂量依赖性,对HCT116蛋白进行免疫荧光检测,结果显示表达量随着蠲毒消瘤饮药物剂量的增加而降低,说明蠲毒消瘤饮能够有效抑制HCT116细胞的增殖,并且存在药物剂量的影响,药物浓度越大抑制效果越明显,突显出中医药在抗肿瘤治疗过程中有着十分重要意义。划痕试验结果显示,中医药作用下HCT116细胞迁移受到显著抑制,随着药物浓度的增加,抑制细胞迁移作用增强;Transwell试验结果显示,蠲毒消瘤饮作用结肠癌细胞能有效抑制细胞的侵袭,随着药物浓度的增加,对侵袭作用的抑制能力逐渐增强。说明中医药在抑制肿瘤细胞侵袭有着明显效果,这对于临床中抑制肿瘤细胞的再分裂和迁移提供有效治疗手段。Annexin V/PI双染法结果显示,当蠲毒消瘤饮作用HCT116细胞后,活细胞数目百分比降低;凋亡细胞数目百分比升高,说明蠲毒消瘤对HCT116 细胞具有凋亡诱导作用,并且该诱导作用具有浓度依赖性。当蠲毒消瘤饮作用HCT116细胞经Western blot法检测细胞内VEGF/MEK/Ras/Raf蛋白表达水平显著降低。研究发现中药蠲毒消瘤在体内体外具有抑制结肠癌细胞生长的作用,并且初步说明中药可能通过调控 Ras/Raf信号通路以及VEGF过程而发挥以上抗癌活性,其机理研究结果显示可以有效改变癌细胞侵袭、迁移,为临床用药提供一定的依据,也为肿瘤的治疗提供了新的靶点和策略。