ω-3 PUFA 在肺结节患者血清中的表达及数字预测模型的建立

姚 益 胡秋霞 李 季 王 毅 杨彦辉 李晓亮 罗 雷 雷 雨 谢晓阳

四川省内江市第一人民医院 重庆医科大学附属内江医院胸心外科，四川内江 641000

肺癌是全球致死率最高的恶性肿瘤。2020 年全球新发的1 929.0 万例癌症病例中肺癌发病率高达220.6 万；995.0 万癌症死亡病例中肺癌死亡高达179.6 万例[1]。肺癌患者的预后依赖于肺部结节的早发现、早诊断。随着低剂量CT（low-dose computed tomography，LDCT）的普及使无症状个体中不确定肺结节的检出率达26.32%～31.00%[2]，增加了早期肺癌检出率从而降低肺癌患者死亡率并延长了生存期[3]。但LDCT 的高假阳性率仍是一个亟须解决的问题。前期研究已显示[4-6]，ω-3 多不饱和脂肪酸（omega-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3 PUFA）作为一种重要的免疫营养物质可使人群肺癌、肝癌、乳腺癌和前列腺癌发病率降低。然而，ω-3 PUFA 在良、恶性肺结节患者血清中表达是否有差异还未见报道。因此，测定比较良、恶性肺结节患者血清中ω-3 PUFA 的浓度差异，并联合LDCT 建立概率预测模型提高肺结节诊断效能对于早期肺癌诊断具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018 年1 月至2021 年12 月四川省内江市第一人民医院胸心外科收治的肺结节患者294 例，年龄25～81 岁。CT 表现为肺实质内直径≤3 cm 且具有清晰或者模糊的边缘，不伴有肺不张、纵隔淋巴结肿大及胸腔积液的类圆形密度增高影定义为肺结节[7]。读片由两名经验丰富的放射科医师诊断确定肺结节影像学特征。纳入标准：①胸部CT 提示直径≤3 cm肺内肿块；②病理诊断明确且资料完整。排除标准：①就诊前已接受过抗肿瘤治疗；②目前患者有严重心、肝、肾功能障碍，或者存在严重感染；③测量前1 周应用过高剂量利尿剂或应用过可影响测量指标相关药物。将患者按约2∶1 比例简单随机抽样分为两组，建模组201 例，验证组93 例。建模组男91 例、女110 例，年龄（56.92±12.44）岁；验证组男53 例、女40 例，年龄（55.06±11.68）岁。本研究经伦理委员会批准（2021-伦审批-43）。

1.2 数据收集

通过手术或肺穿刺活检明确肺结节病理。比较两组基线临床资料（性别、年龄、吸烟史、肿瘤病史），ω-3 PUFA，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell antigen，SCC），细胞角蛋白19 片段抗原（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）；CT 影像学重要指标[8-9]（病灶直径、肿瘤实性成分直径比值（consolidation/tumor ratio，CTR），血管征，支气管充气征、结节边界、短毛刺、分叶征、胸膜牵拉）。其中ω-3 PUFA 浓度通过酶联免疫吸附试验法测定，其他指标通过医院病历及检验系统收集并将CEA≤5.09 ng/ml定义为阴性，＞5.09 ng/ml 定义为阳性，将SCC≤1.50 ng/ml定义为阴性，＞1.50 ng/ml 定义为阳性；将CYFRA21-1≤3.30ng/ml 定义为阴性，＞3.30 ng/ml 定义为阳性。

1.3 酶联免疫吸附试验法检测ω-3 PUFA 浓度

收集患者入院时空腹全血，静置1 h 后离心（3 000 r/min，10 min，离心半径6 cm）收集血清。根据ω-3 PUFA 酶联免疫试验法试剂盒（南京卡米洛生物公司，批号：190909）使用说明书将包被好抗体的96孔板加待检抗原，37℃60 min，洗涤3 次后抛干，加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2）再次37℃、60 min 孵育，洗涤3 次后抛干；加入酶标抗Ab-2 抗体→37℃、60 min，洗涤3 次后抛干；加底物液→37℃、20 min，加终止液；用酶标仪（美国Thermo公司）测定OD 值并换算为ω-3 PUFA 浓度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验。计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验或Fisher确切概率法。采用logistic 回归分析影响因素，并建立预测模型并给予验证。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ω-3 PUFA 在良恶性肺结节中浓度

建模组201 例患者中恶性162 例，良性39 例。分析建模组中良恶性肺结节患者血清中ω-3 PUFA 的浓度，恶性组[（17.10±13.24）ng/ml]低于良性组[（24.85±14.84）ng/ml]，差异有统计学意义（t=3.204，P＜0.05）。

2.2 建模组肺结节良恶性单因素分析

单因素分析结果显示，两组性别、年龄、吸烟史、肿瘤病史、CEA、SCC、CYFRA21-1、病灶直径、支气管充气征、边界不光滑、分叶征比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。建模组肺结节良性和恶性患者ω-3 PUFA、病灶直径、CTR、血管征、短毛刺、胸膜牵拉比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 建模组肺结节良恶性单因素分析

2.3 建模组肺结节良恶性多因素分析

通过上述单因素分析，将单因素分析中差异有统计学意义（P＜0.05）的ω-3 PUFA、病灶直径、CTR、血管征、短毛刺、胸膜牵拉6 项数据纳入多因素分析。结果显示，ω-3 PUFA、CTR、血管征、短毛刺、胸膜牵拉是判断肺结节良恶性的独立影响因素（P＜0.05）。见表2。

表2 建模组肺结节良恶性多因素分析

2.4 建立临床预测模型及验证

根据多因素分析结果，建立肺结节良恶性预测模型：P=ex/（1+ex），X=-5.020+（0.042×ω-3 PUFA 阳性）+（1.613×CTR）+（1.185×短毛刺）+（1.081×胸膜牵拉）+（0.936×血管征）。其中P 为恶性结节预测值概率，e 为自然对数，X根据ω-3 PUFA、CTR、有无短毛刺、有无胸膜牵拉、有无血管征不同而变化。ω-3 PUFA为具体实测值（ng/ml）；CTR≥0.5=1，CTR＜0.5=0；有短毛刺=1，无短毛刺=0；有胸膜牵拉=1，无胸膜牵拉=0；有血管征=1，无血管征=0。将建模组数据带入预测模型中计算出肺恶性概率并绘制ROC 曲线，结果显示，诊断模型的AUC（95%CI）为0.837（0.770～0.904），灵敏度、特异度分别为74.5%、84.6%。见图1～2、表3。将验证组数据代入预测模型并绘制ROC 曲线，AUC（95%CI）为0.780（0.651～0.908）。见图3。

图1 基于预测模型绘制ROC 曲线

图2 基于ω-3 PUFA 绘制ROC 曲线

图3 基于验证组数据验证预测模型ROC 曲线

表3 ROC 曲线分析结果

3 讨论

肺癌是全世界致死率最高的恶性肿瘤[1]。肺癌总人群5 年生存率只有约19%[10]，而ⅠA 期肺癌患者术后5 年生存率已超过70%，其中原位腺癌和微浸润腺癌术后5 年生存率更是接近100%[7]。随着LDCT 的普及，越来越多影像学表现为孤立性不确定肺结节被发现[11]，且多发性肺结节患者达到14.5%[12]，提高了早期肺癌诊断率并降低了肺癌患者死亡率[3,13]。然而，不管是LDCT 还是前期对肺结节进行良恶性预测的Mayo模型[14]、VA 模型[15]、Brock 模型[16]和PKUPH 模型[17]都因自身局限性使用受到限制。因此，引入新的生物标志物制订新的预测模型具有重要意义。

研究结果显示，恶性肺结节患者血清中ω-3 PUFA 浓度低于良性肺结节组。因此，本研究在传统的患者病历资料、肿瘤标志物、影像学特征等基础上，增加了ω-3 PUFA 这一有意义的新的生物标志物纳入研究，是一项更为全面的综合性诊断模型。本研究多因素分析发现ω-3 PUFA 降低、CTR≥0.5、具有短毛刺、血管征、胸膜牵拉等影像学特征是恶性肺结节独立危险因素。其中，ω-3PUFA 是重要的一种免疫营养物质[4]。相关流行病学调查结果显示，高摄入ω-3 PUFA 可使人群肝癌、乳腺癌和前列腺癌发病率降低[5]，可见ω-3 PUFA 为肝癌、乳腺癌和前列腺癌患者的保护性因素。在肺癌中亦是如此，Song 等[6]meta 分析结果表明富含ω-3 PUFA 的鱼类进食量与肺癌发病率呈负相关。同时也有研究表明，补充ω-3 PUFA 能改善肺癌患者预后，延长患者生存期[18]。这有可能与以下原因有关：①ω-3 PUFA 可以通过PI3K/Akt 等信号通路抑制肺癌细胞的生长、迁移和侵袭转移[19]；②补充ω-3 PUFA 可以改善肺癌患者的免疫营养状况并抑制全身性的炎症反应，从而抑制肿瘤生长[20]；③ω-3 PUFA的过氧化可加速肿瘤细胞的铁死亡[21]。本研究在CT影像学特征上得到与前期研究相同的结果，肺结节向周围肺实质伸展浸润形成的短毛刺[22]、动脉和静脉等血管向病灶集中或受牵拉形成的血管征[23-24]及CTR增高是肺癌的独立危险因素，预示着肺癌的可能且恶性程度更高。亦有研究表明[25]，肺结节性质与结节直径密切相关。而本研究中单因素分析结果显示病灶直径对于结节良恶性判断具有统计学差异，而多因素分析结果未纳入病灶直径这一因素进入预测模型公式。这可能是因为良恶性不仅与结节直径有关，实性成分占比亦具有重要价值[26]。本研究诊断模型的AUC 为0.837，灵敏度、特异度分别为74.5%和84.6%，同时使用验证组数据对模型进行了验证均具有较高诊断价值。相较于单独使用ω-3 PUFA、CTR、血管征、毛刺征、胸膜牵拉诊断肺结节良恶性具有更高的特异度和灵敏度。所建立起的模型是一种相对无创、经济方便的肺结节预测模型，可为临床不确定肺结节良恶性鉴别提供参考。

本研究将ω-3 PUFA 这一血清生物标志物与CT特征结合起来建立预测模型来判断肺结节的良恶性，但仍存在不足之处：①由于研究纳入患者为高度怀疑恶性肺结节且收治入院行手术或穿刺活检明确病理患者，所获得的结论可能存在一定选择偏差；②本研究纳入294 例患者为研究对象，样本例数相对不足，后期还需加大样本量进一步验证。