拉帕替尼和阿司匹林双联化合物的设计、合成及其体外活性研究

袁盼盼 郭凯丽 姚 琳 过晓芳 刘继平 王 斌 王国全 朱星枚

1.陕西中医药大学陕西省中医药基础与新药研究重点实验室，陕西咸阳 712046；

2.陕西省中医药管理局中药药效与物质基础重点实验室，陕西咸阳 712046；

3.空军军医大学药学系药物化学与药物分析教研室，陕西西安 710032；

4.西安工业大学理学院，陕西西安 710021

研究表明，原癌基因人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）在15%～20%的乳腺癌中过度表达，与乳腺癌的发生、发展和预后密切相关[1-2]。拉帕替尼是继曲妥珠单抗之后第2个被美国FDA 批准用于HER2 阳性乳腺癌的分子靶向药物[3-4]。但是，拉帕替尼的单药响应率仅为24%，大多数患者在用药6 个月左右出现耐药[5-6]。阿司匹林是常见的非甾体类抗炎药，已被证明具有较广谱的抗肿瘤作用[7-10]。临床研究表明，阿司匹林对PIK3CA 突变型乳腺癌患者有效[11-12]。课题组前期实验表明，低剂量阿司匹林联合拉帕替尼用药较单用拉帕替尼或阿司匹林，可以更有效地抑制HER2 阳性乳腺癌细胞增殖，显著增强肿瘤细胞凋亡率[13]。鉴于此，本研究设计、合成了阿司匹林和拉帕替尼的孪药（CompdⅠ），希望其能发挥两药协同抗HER2 阳性乳腺癌的作用。本研究初步评价了CompdⅠ抗HER2 阳性乳腺癌的作用，采用分子对接技术[14]探讨了其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器

HF240 细胞培养箱[力新仪器（上海）有限公司]；酶标仪[安捷伦科技（中国）有限公司]；蛋白凝胶电泳仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]；TGL-16M 冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；JY 92-IIN 超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；GBOX-Chemt-XRQ 化学发光成像系统（基因有限公司）；AVANCE NEO 400M 核磁共振仪、Bruker micro TOF-Q Ⅱ高分辨质谱仪[布鲁克（中国）有限公司]。

1.2 试剂与细胞

胎牛血清（GEMINI，批号：A44H102L）；RPMI 1640培养基（Hyclon，批号：AF29520450）；拉帕替尼（≥98%）、阿司匹林（≥99%）（北京谨明生物科技有限公司，批号：CSD18L15150G、C19PA44825A）；TBTU[≥99%，吉尔生化（上海）有限公司，批号：GLS140530-00705]；三乙胺（≥99%，阿拉丁（上海）生化科技股份有限公司，批号：F2002079）；CCK-8（恩晶生物科技有限公司，批号：EG20220915）；β-actin、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、HER2、Akt1、p-Akt1-Ser1-24、p-Akt1-Ser169、mTOR、p-mTOR 和HRP-羊 抗兔IgG 抗体（博士德生物工程有限公司，批号：XA517-1BP11766、BST17124009、BST1704094、BST-17514390、BST19264762、BST17084744、BST17064182、BST177-14840、BST17H08A17H54）；AMPK、p-AMPK抗体（爱博泰克生物科技有限公司，批号：5500006292、216013008）；RIPA 细胞裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号：031020200604、092721220221）；ECL 超敏发光液（新赛美生物科技有限公司，批号：ECL-001）。人乳腺癌细胞BT474（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 CompdⅠ的合成

0℃氮气保护下，拉帕替尼（76 mg，0.13 mmol，1.3 equiv）、阿司匹林（18 mg，0.1 mmol，1.0 equiv）、TBTU（38.5 g，0.12 mmol，1.1 equiv）于CH2Cl2（10 ml）中充分搅匀，然后加入三乙胺（35 μl，0.25 mmol，2.5 equiv），室温搅拌过夜，加入NH4Cl 溶液（20 ml）使反应淬灭。室温下剧烈搅拌20 min，分离有机层，无水Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩得粗产物。乙酸乙酯溶解粗产物，依次经0.1 mol/L HCl 溶液（15 ml×3次），饱和NaH CO3（20 ml×2 次）洗涤，干燥，过滤，真空浓缩。残余物经硅胶（200～300 目）柱层析（洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（50∶1）纯化得亮黄色固体粉末CompdⅠ55 mg。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 8.70（s，1H），8.63（s，1H），8.48（s，1H），7.94（d，J=7.5 Hz，1H），7.88（d，J=6.2 Hz，2H），7.77（d，J=8.6 Hz，1H），7.52（d，J=7.2 Hz，1H），7.37（d，J=11.2 Hz，3H），7.24（t，J=11.1 Hz，2 H），7.00～7.05（m，2H），6.73（s，1H），6.33（s，1H），5.18（s，2H），4.54（s，2H），4.23（s，2H），3.47（s，2H），3.03（s，3H），2.25（s，3H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 169.57（s），168.62（s），164.26（s），161.81（s），157.95（s），154.95（s），153.74（s），150.86（s），149.80（s），149.42（s），147.41（s），139.19（d，J=7.4 Hz），132.77（s），131.25（s），130.20（d，J=8.2 Hz），128.95（d，J=10.3 Hz），128.36（s），128.08（s），127.86（s），126.00（s），124.78（s），123.25（s），122.50（s），122.01（s），114.97（dd，J=80.4，59.2 Hz），114.81（s），114.57（d，J=48.4 Hz），114.33（s），114.13（s），113.91（s），112.12（s），107.28（s），70.46（s），51.72（s），46.52（s），41.43（s），39.75（s），29.72（s），21.04（s）；19F NMR（376 MHz，CDCl3）δ -112.62（s）；HRMS（ESI）：m/z for C38H32ClFN4O7S [M+H]+calcd 743.174 4，found 743.174 9。

1.3.2 CompdⅠ抗HER2 阳性乳腺癌细胞BT474 增殖作用

1.3.2.1 CCK-8 实验 将BT474 细胞（5×103/ 孔）接种于96 孔板，待细胞贴壁后，分别加入CompdⅠ（0、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00、2 000.00、4 000.00、8 000.00 nmol/L），拉帕替尼（0、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00、2 000.00、4 000.00、8 000.00 nmol/L），阿司匹林（0、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、20.000 0、40.000 0 mmol/L），5%CO2、37℃培养箱孵育24、48、72 h。依据文献[15]测定并计算其半数抑制浓度（median inhibitory concen tration，IC50）。每组5 个复孔，重复3 次。

1.3.2.2 平板克隆试验 取对数期细胞（1×103/孔）接种于六孔板中。将细胞分为空白组、阿司匹林组（5 mmol/L）、拉帕替尼组（500 nmol/L）、CompdⅠ（500 nmol/L）组。各组培养48h后更换完全培养基培养21 d，参考文献[16]观察并计算克隆形成率。每组重复3次。1.3.2.3 分子对接 使用AutoDock 4.2，将CompdⅠ与PDB 数据库（https：//www.RCSB PDBus.org/）中获取的靶蛋白[EGFR、HER2、AMPK、Akt1、mTOR、环氧合酶1（cyclooxygenase 1，COX1）]进行分子对接[17-19]，使用PYMOL 进行可视化。

1.3.2.4 Western blot 将不同药物处理的BT474 细胞用预冷的RIPA 裂解，BCA 法检测蛋白质浓度。参考文献[20-21]上样，转膜、封闭，采用兔β-actin，EGFR、HER2、AMPK、p-AMPK、Akt1、p-Akt1-Ser124、p-Akt1-Ser169、mTOR、p-mTOR 抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜，并用HRP 标记山羊抗兔IgG 室温下孵育1 h（1∶7 500）；TBST 洗涤10 min，重复3 次，ECL 发光，分析各蛋白的表达量。Image J 软件计算灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CompdⅠ的合成

以拉帕替尼和阿司匹林为原料经过缩合反应合成CompdⅠ，产率为78%，熔点为101.7～102.7℃。合成路线见图1。

图1 CompdⅠ的合成路线

2.2 CompdⅠ抑制BT474 细胞增殖

不同浓度的CompdⅠ培养24、48、72 h 均能抑制BT474 细胞增殖，见图2A；培养24、48、72 h，CompdⅠ与拉帕替尼和阿司匹林的IC50比较，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），见表1；与空白组比较，阿司匹林组、拉帕替尼组、CompdⅠ组的克隆形成率更低，与阿司匹林组、拉帕替尼组比较，CompdⅠ组的克隆形成率更低，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），见图2B～C。

表1 阿司匹林、拉帕替尼和CompdⅠ对BT474 细胞的IC50 比较（，n=3）

注 与拉帕替尼组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；与阿司匹林组比较，ccP＜0.01。IC50：半数抑制浓度

2.3 CompdⅠ与增殖通路相关靶点结合与验证

2.3.1 CompdⅠ与增殖通路相关靶点分子对接结果

CompdⅠ与EGFR、HER2、AMPK、Akt1、mTOR 结合能绝对值均≥5 kcal/mol，且与EFGR、Akt1、mTOR对接能较拉帕替尼更低；CompdⅠ与COX1 不能结合，而阿司匹林与COX1 有较低的结合能（-7.054kcal/mol），见表2。以CompdⅠ与EGFR、HER2 结合为例，其对接结果见图3。

表2 CompdⅠ与EGFR、HER2、AMPK、Akt1、mTOR及COX1 对接的结合能（kcal/mol）

图3 CompdⅠ、拉帕替尼分别与AMPK/mTOR 增殖通路相关靶点分子对接

2.3.2 CompdⅠ对AMPK/mTOR 通路蛋白的影响

与空白组比较，CompdⅠ组和拉帕替尼组EGFR、HER2、p-Akt1-Ser124、p-Akt1-Ser169、Akt1、p-mTOR及mTOR 下调，阿司匹林组p-Akt1-Ser169、p-mTOR下调，CompdⅠ组p-AMPK 和AMPK 上调，拉帕替尼组AMPK 上调，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。与拉帕替尼组比较，CompdⅠ组p-AMPK 上调，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见图4。

图4 CompdⅠ、拉帕替尼和阿司匹林对BT474 细胞中AMPK/mTOR 通路蛋白的影响（n=3）

3 讨论

本研究采用拼合原理，通过缩合反应一步合成拉帕替尼和阿司匹林的孪药[22-23]。初步研究发现，CompdⅠ可以抗BT474 细胞增殖，且较拉帕替尼杀伤作用更强。与拉帕替尼比较，CompdⅠ有更强的激动AMPK，抑制Akt/mTOR 作用。可能因为其既发挥拉帕替尼拮抗HER2/EGFR 作用，同时依赖阿司匹林激活AMPK，抑制mTOR 作用[24]。此外，因阿司匹林对COX 的非选择性作用，常导致消化系统溃疡等不良反应[25]，而分子对接显示CompdⅠ与COX1 没有结合作用。因此，与阿司匹林、拉帕替尼药物比较，CompdⅠ的副作用可能更小。同时，CompdⅠ药物服用更方便，可提高患者的依从性，值得进一步研究。