基于网络药理学及分子对接预测栀子治疗急性酒精性肝损伤的分子机制

段文婷,马丽杰,金蓉,谭真真

栀子为很多传统保肝方剂的主要成分,例如蒙药古日古木-13味丸在临床中用于脂肪肝、药物性肝损伤、酒精性肝炎及病毒性肝炎等肝热性病,栀子大黄汤在临床用于黄疸型及非黄疸型肝炎等肝胆疾病,查阅大量文献可知,栀子作用于急性酒精性肝损伤时有明显效果,且对肝损伤有很好的保护作用[1]。中医在临床上常用栀子泻火除烦、清肝明目、消肿活络及凉血解毒。中草药本就是包含多种化学成分并拥有多个靶点的复合体,这正与网络药理学有很多相似之处,因此,应用网络药理学及分子对接技术为探究中药治疗疾病的分子机制提供专业技术支持,有助于指导中药新药研发及中医药理论发展。本研究基于网络药理学及分子对接预测栀子治疗急性酒精性肝损伤的分子机制,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 栀子有效成分及靶点的筛选 利用TCSMP中药系统药理学数据库和分析平台,以“栀子”为关键词检索用以获取栀子有效成分及作用靶点[2]。根据药代动力学原则,设置口服利用度(OB)≥30%,设置类药性(DL)≥0.18。去重和筛选后,运用Uniprot蛋白质数据库对靶点进行标准化。

1.2 疾病相关靶点筛选 以“Acute alcoholic liver injury”、“Acute alcoholic hepatic injury”为关键词,在OMIM、Genecards、DRUGBANK、TTD等疾病数据库收集疾病靶点。将4个疾病数据库的靶点进行汇总去重,得到急性酒精性肝损伤靶点。

1.3 蛋白质相互作用网络的构建 将候选靶点导入STRING 11.0平台构建蛋白质相互作用(PPI)网络。

1.4 通路富集分析 运用Metascape平台对栀子作用于急性酒精性肝损伤的候选靶点进行基因本位(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,并将得到的数据在Bioinformatics平台进行可视化。

1.5 有效成分—靶点—通路网络的构建 运用Cytoscape 3.8.2构建网络,并分析网络。在拓扑参数中显示连接度越大说明节点的连线越多,代表这个有效成分、靶点或通路在网络中越重要。根据分析得到核心靶点、重要成分和关键通路。

1.6 有效成分和核心靶点的分子对接 利用STRING 11.0平台的PPI网络图,查看核心靶点相关信息并收集大分子受体的PDB编号,在PDB数据库下载大分子高分辨率PDB文件作为刚性受体。在TCMSP数据库下载小分子有效成分的MOL2文件作为构象可变化柔性配体。运用AutoDock 4.2.6对配体和受体进行半柔性分子对接,根据AutoDock Vina评分函数计算自由结合能,当自由结合能≤-5.0 kJ/mol时,表明受体和配体对接良好,数值越小表明结合能力越好[3]。均方根偏差RMSD值应≤2A,说明该对接体系适用于配体成分与受体的半柔性对接[4]。再利用PyMOL软件对自由结合能较低的对接结果进行可视化。

2 结 果

2.1 栀子有效成分及靶点的筛选 利用TCMSP数据库对栀子进行检索,得到有效成分98个,根据药动学特征筛选,得到有效成分15个。将有效成分在数据库中进行检索,其中8个有效成分有相关靶点(槲皮素、苏丹红3号、山奈酚、豆甾醇、西红花酸、β-谷甾醇、欧前胡素及伞房花耳草素),删除另外7个无相关靶点的有效成分。在蛋白质数据库中保存数据,利用表格中VLOOKUP函数对照上述结果规范栀子作用靶点,去除重复靶点,得到栀子作用靶点163个。运用Cytoscape 3.8.2构建栀子有效成分—靶点网络,分析网络得到有效成分的连接度值,其中排名前3位的是槲皮素连接度值为98,苏丹红3号连接度值为8,山奈酚连接度值为6。

2.2 疾病相关靶点的筛选 在Genecard数据库中检索疾病,获得靶点4 904个,设置2次中位数卡值得到潜在靶点1 221个,在OMIM数据库中获得靶点257个,在TTD数据库中获得靶点3个,在DRUGBANK中获得靶点12个,汇总去重,获得疾病靶点1 416个。

2.3 PPI构建 将筛选得到的栀子靶点43个和急性酒精性肝损伤靶点1 296个分别录入Venny 2.1.0平台,获得交集靶点120个,占比8.96%,交集得到的靶点作为栀子治疗疾病的候选靶点。将候选靶点录入STRING 11.0平台获取PPI网络,为根据链接度值更加清晰了解靶点之间的相互作用及更直观看到核心靶点,将PPI数据导入Cytoscape 3.8.2中进行网络构建,该网络包含120个节点和2 164条边,根据网络分析结果显示,AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF、CASP3、JUN、EGF、MAPK8、PTGS2等为栀子治疗急性酒精性肝损伤的核心靶点。

2.4 富集通路分析及可视化 在Metascape平台中输入候选靶点,设置物种选择为H.sapiens且选择Custom Analysis个性化分析,设置P值≤0.01,利用Metascape进行GO和KEGG富集分析,GO分析包括生物过程、分子功能及细胞组成等,利用Metascape平台富集出生物进程1 891条、分子功能164条、细胞组成69条及KEGG通路331条。对GO和KEGG的富集结果利用Bioinformatics平台分别绘制柱状图和气泡图,见图1。从GO柱状图可看出参与栀子作用于疾病的重要生物学过程包括炎性反应、凋亡信号通路、对细菌的反应、对脂多糖的反应及对细菌来源分子的反应等;从气泡图可得关键的KEGG通路富集有癌症通路、乙型肝炎、丙型肝炎及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路及INF信号通路等。

2.5 有效成分—靶点—通路网络的构建 将准备好的网络文件和属性文件录入Cytoscape 3.8.2平台进行网络构建,并分析网络,设置连接度值越大的节点面积越大、颜色越深,见图2。槲皮素是栀子治疗急性酒精性肝损伤的主要有效成分,其次是山奈酚、西红花酸及苏丹红3号。与之相关连接度值较大的通路为癌症通路、乙型肝炎及丙型肝炎等。

2.6 有效成分和核心靶点的分子对接 栀子有效成分槲皮素、苏丹3号、山奈酚、豆甾醇、西红花酸、β-谷甾醇、欧前胡素及伞房花耳草素作为小分子配体,PPI网络图前3位核心靶点AKT1、IL6、TP53作为大分子受体。将大分子PDB文件导入AutoDockTools软件中,利用软件去除水分子,添加全部氢键,设置为受体并保存为PDBQT文件。然后,将小分子MOL2文件导入AutoDockTools软件中,添加全部氢键,检测扭转键并且选择扭转键,设置为配体并保存PDBQT文件,设置为配体时软件自动分配电荷。设置受体对接盒子并导出为GPF文件,运行Autogrid4,设置对接参数和运算方法,运行AutoDock4,最后,查看并保存对接结果,见表1。得到的自由结合能均远远>5 kJ/mol,大部分对接结果的RMSD值<2,说明这些配体和受体可很好对接,进一步证明栀子治疗急性酒精性肝损伤的可靠性和有效性。对自由结合能结果由低到高排序,前3位为豆甾醇与AKT1的结合能-35.35 kJ/mol,形成1个氢键,形成氢键的氨基酸残基为GLU95;β-谷甾醇与AKT1的结合能-30.71 kJ/mol,形成1个氢键,形成氢键的氨基酸残基为VAL4;豆甾醇与TP53的结合能-28.66 kJ/mol,形成1个氢键,形成氢键的氨基酸残基为ASP217。

表1 栀子治疗急性酒精性肝损伤有效成分和核心靶点的分子对接结果表

注:菱形代表有效成分;圆形代表靶点;箭头代表通路

3 讨 论

本研究利用网络药理学构建栀子的成分—靶点网络,得到栀子作用于急性酒精性肝损伤的有效成分为槲皮素、山奈酚、豆甾醇、西红花酸及β-谷甾醇等。槲皮素相关靶点有AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF、CASP3、JUN等121个,槲皮素是多酚类中具有生物活性的类黄酮,具有清除自由基、抗增殖和抗炎性反应的特性。Liu等[5]实验研究表明槲皮素对急性酒精性肝损伤的保护作用是通过诱导HO-1抑制NLRP3炎性小体的激活。其机制可能是HO-1发挥抗氧化作用,减少酒精损伤中活性氧的产生,进而抑制NLRP3炎性小体的激活。豆甾醇相关靶点有NR3C2、ADH1C、NCOA1、ADRA2A等9个靶点,Feng等[6]经过33周的研究后证明豆甾醇和β-谷甾醇对高脂肪食物摄入引起的NAFLD具有明显保护作用。西红花素相关靶点有CHRM3、CHRM1、ADRA1A、CHRM2等9个靶点,西红花素具有较强的体内抗氧化活性,且研究发现西红花素等栀子有效成分可显著降低Ccl4诱导的肝损伤小鼠ALT、AST及ALP水平。

经PPI网络筛选,得到栀子作用于急性酒精性肝损伤的核心靶点为AKT、IL6、TP53、VEGFA、TNF、CASP3、JUN、EGF、MAPK8等,其中AKT1在癌症进展过程中调节代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等生物过程;IL6主要在炎性反应部位产生并分泌到血清中,通过白介素6受体α诱导转录炎性反应,该基因的功能涉及多种与炎性反应相关的疾病;TP53基因是一种抑癌蛋白,主要在诱导细胞周期停滞、凋亡、衰老、DNA修复或代谢改变过程中起作用[7]。多项研究已证实促炎细胞因子IL-6和TNF参与肝脏损伤发生、发展的整个病程且在肝脏疾病恶化严重时期起到关键作用,经研究证明促炎性细胞因子的浓度越高则肝损伤越严重,呈正比例关系[8]。综上所述,中药栀子通过多靶点对急性酒精性肝损伤进行全方位调治。

对GO生物进程结果进行分析,氧化应激反应被认为是肝脏疾病进程中重要反应之一,在肝脏损伤进展中起关键作用。在酒精性肝损伤的整个肝脏病变过程中,细胞损伤、炎性反应、氧化应激、再生及细菌易位是促使脂肪变性到肝硬化的关键驱动因素[9]。对KEGG的通路结果分析表明,引起局部组织损伤是糖基化终末产物(AGE)与其受体RAGE的相互作用,介导细胞内氧化应激和炎性反应所致,故在急性酒精性肝损伤初期抗氧化应激和炎性反应有积极作用[10]。IL-17通过释放前炎性细胞因子诱导分化细胞因子IL-6、TNF等,促进炎性反应,促进急性酒精性肝损伤疾病发展,与疾病发生发展呈正相关[11]。MAPK/ERK信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡的过程,是肝损伤发展至肝癌过程中重要通路之一[12]。且研究显示,炎性反应和氧化应激反应与NF-кB/p38MAPK信号通路联系紧密[13]。

根据计算机实验模拟核心靶点和小分子的分子对接发现急性酒精性肝损伤有关的蛋白通路对接分子和对接方式,对接方式有直链式和镶嵌式。在不改变对接方式前提下,对对接分子结构进行修饰,为下一步研究急性酒精性肝损伤靶向药物提供科学方向。本研究存在局限性,网络药理学是基于网络数据库的研究,并没有包含中药在煎煮过程中成分间发生相互作用及中药进入人体内发生的化学反应,故本研究仅能接近但无法将反应计入。故后期还需要结合实验及大量临床研究进行验证,为下一步实验验证和研究提供方向。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。