SGLT2抑制剂对糖尿病肾病大鼠的降糖作用及肾脏保护作用

曹冰,刘颖,陆晨

糖尿病肾病(DKD)为目前引起终末期肾病的主要原因之一,血糖和血压的控制可减缓糖尿病肾病的发生和进展。钠葡萄糖共转运体2(SGLT2)抑制剂是一种新型的降糖药物,目前被认为具有降糖依赖性和非依赖性的肾脏保护作用。实验研究表明,在1型糖尿病和2型糖尿病的动物模型中,SGLT2抑制剂均可减轻糖尿病肾病的病变,表明除了降糖外,SGLT2抑制剂还具有潜在的肾脏保护作用。在随机对照试验中,SGLT2抑制剂已经被证实对合并高心血管风险的糖尿病肾病患者存在肾脏保护作用。SGLT2抑制剂的这些有利作用可通过几种潜在的机制来解释,包括减轻肾小球高滤过、炎症和氧化应激。本实验建立糖尿病肾病大鼠模型,并给予卡格列净药物干预,观察给药后大鼠血糖、肾脏系数、尿蛋白及相关生化指标的变化情况,进一步评价SGLT2抑制剂对糖尿病肾病的保护作用。总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取由新疆医科大学第一附属医院动物饲养中心提供的SPF级雄性Wistar大鼠30只,8～10周龄,体质量200～250 g,于新疆医科大学动物实验中心进行繁育,饲养温度(23±3)℃,相对湿度40%～70%。该研究通过新疆医科大学实验动物伦理委员会审批(伦理审批号:IACUC-20210425-14)。

1.2 仪器与试药

1.2.1 仪器:电热恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司DNP-9272);酶标仪(美国Bio-Rad xMarkTM);高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技公司);常规电泳仪电源(北京百晶生物技术有限公司BG-Power600i);电泳仪(北京六一生物科技有限公司DYCZ-21);手动单道移液器(德国Eppendorf公司Research plus)等。

1.2.2 试药:链脲佐菌素(STZ,sigma公司生产);卡格列净片(Janssen-Cilag S.p.A.意大利生产,规格:100 mg)。

1.2.3 饲料:45%高脂饲料(日粮型,大鼠)、普通饲料,由江苏协同医药生物工程有限责任公司提供。

1.3 方法

1.3.1 分组:将30只雄性大鼠适应性喂养1周后,采用随机数字表法分为卡格列净药物干预组(10只)、糖尿病肾病组(10只)及对照组(10只)。

1.3.2 糖尿病肾病大鼠模型造模及干预方法:大鼠普通饲料适应性喂养1周后,卡格列净药物干预组及糖尿病肾病组大鼠继续给予高脂高糖饲料喂养4周(对照组大鼠给予普通饲料喂养4周),第5周第1天卡格列净药物干预组及糖尿病肾病组大鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg(pH 4.45、0.01 mol/L无菌柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液) 1次,对照组大鼠注射等体积溶剂。注射第3天卡格列净药物干预组及糖尿病肾病组大鼠均测随机血糖1次,随机血糖<11.1 mmo/L的大鼠,需重新注射1次STZ(50 mg/kg),7 d后,连续3 d尾静脉取血,随机血糖≥16.7 mmo/L,若大鼠出现多饮、多食、多尿、体质量下降的症状及尿检白蛋白升高、毛发枯黄、精神萎靡、反应迟钝等现象则证明造模成功。次日开始予卡格列净药物干预组卡格列净10 mg/kg灌胃,对照组及糖尿病肾病组予蒸馏水(等体积)灌胃,持续灌胃37 d后处死大鼠。

1.3.3 样本收集

1.3.3.1 血清样本收集:大鼠处死12 h前禁食,处死后收集腹腔动脉血1～2 ml,分离血清,于-80 ℃下保存待测。

1.3.3.2 组织样本收集:大鼠处死后,收集肾脏组织,称重。

1.3.3.3 尿液样本收集:大鼠处死前1 d内收集24 h尿液,于-80 ℃冰箱内保存待测。

1.4 观察指标及方法 (1)血糖测定:大鼠饲养5周后,每周使用血糖仪检测空腹血糖水平。(2)体质量测定:大鼠饲养5周后,每周对大鼠体质量进行称量,记录体质量变化,并计算肾脏系数(肾脏重量/体质量)。(3)尿蛋白含量:取各组4个时间点采集的尿液,按照尿蛋白指标试剂盒说明书操作,记录测定的吸光度(OD值),通过计算公式得到尿蛋白浓度。(4)生化指标检测:检测大鼠血清中葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平。

2 结 果

2.1 血糖比较 卡格列净药物干预组及糖尿病肾病组大鼠空腹血糖均明显高于对照组(P<0.05);卡格列净药物干预组在卡格列净干预第18天空腹血糖低于糖尿病肾病组(P<0.05),见图1。

图1 3组大鼠空腹血糖水平变化

2.2 肾脏系数比较 卡格列净药物干预组及糖尿病肾病组大鼠肾脏系数高于对照组(P<0.05);卡格列净药物干预组经卡格列净药物干预后肾脏系数水平较糖尿病肾病组有所下降,见表1。

表1 3组大鼠肾脏系数比较

2.3 尿蛋白比较 卡格列净药物干预组及糖尿病肾病组尿蛋白含量均高于对照组(P<0.05);卡格列净药物干预组大鼠处死前尿蛋白含量低于糖尿病肾病组(P<0.05),见表2。

2.4 生化指标比较 糖尿病肾病组GLU、BUN、Cr、TC、TG水平均高于对照组(P<0.05);卡格列净药物干预组GLU、BUN、Cr、TC、TG水平均低于糖尿病肾病组(P<0.05),见表3。

3 讨 论

糖尿病肾病是糖尿病患者严重的并发症之一,部分患者最终会进展为终末期肾病,需肾脏替代治疗,糖尿病肾病患者的病死率明显高于不伴肾病的糖尿病患者。持续高血糖的存在可导致糖基化中间产物堆积及脂蛋白代谢异常,最终导致糖尿病肾病的发生[1]。目前糖尿病肾病的防治重点是积极控制相关的危险因素,其中包括体质量、血糖、血压、血脂、尿酸及尿蛋白水平等,从而降低肾脏及心血管事件发生的风险。

表2 3组大鼠不同时点尿蛋白含量比较

表3 3组大鼠相关生化指标比较

SGLT2抑制剂是一种新型的降糖药物,该药物已被证实在降低血糖的同时,进一步降低心血管危险因素,并起到肾脏保护作用,其主要通过抑制SGLT2的转运作用从而使肾脏对葡萄糖重吸收减少,促进尿钠、尿糖的排出[2],其为降低糖尿病肾病早期高滤过提供了基础。SGLT2抑制剂的降糖作用与体内葡萄糖浓度和肾小球滤过率呈正比,其还可通过改善糖尿病肾病患者的胰岛β细胞功能和胰岛素敏感性进一步降低血糖[3]。研究显示SGLT2抑制剂除了降糖作用之外,还有改善血压及血脂、降低血尿酸、减轻体质量、减少尿蛋白、改善动脉硬化和内皮功能、改善肾小球超滤、抑制炎性损伤和纤维化等作用,延缓糖尿病肾病的进展[4]。本实验建立了糖尿病肾病大鼠模型,并给予卡格列净药物干预,观察给药后大鼠血糖、肾脏系数、尿蛋白及相关生化指标的变化情况,进一步评价SGLT2抑制剂对糖尿病肾病的保护作用。

本研究结果显示,卡格列净药物干预组及糖尿病肾病组大鼠空腹血糖均高于对照组(P<0.05);卡格列净药物干预组在卡格列净干预第18天后空腹血糖低于糖尿病肾病组(P<0.05),提示卡格列净具有较好的降糖作用。卡格列净药物干预组及糖尿病肾病组大鼠肾脏系数高于对照组(P<0.05);卡格列净药物干预组经卡格列净药物干预后肾脏系数水平较糖尿病肾病组有所下降。SGLT2抑制剂可促进尿糖的排出,进而降低血糖水平,同时对代谢因素、胰岛素敏感性和β细胞功能存在一定程度的影响。研究发现,在糖尿病肾病患者中,SGLT2的表达增加,肾糖阈升高,同时葡萄糖的重吸收增加,进一步升高血糖,而SGLT2抑制剂可使病理性升高的肾糖阈降低,降低肾小管对葡萄糖的重吸收,从而发挥降血糖、降低细胞糖毒性的作用,同时还可增强β细胞的功能、改善胰岛素抵抗及改善胰岛素敏感性。Kutoh等[5]研究发现,在T2DM患者中应用SGLT2可降低体质指数和HOMA-R。Tahara等[6]在高脂饮食诱导的糖尿病动物模型中,证明了SGLT2对非酒精性脂肪性肝病的有效治疗。在高脂肪和高胆固醇饮食喂养的T2DM小鼠中,SGLT2单独和与二甲双胍联用通过减轻肝脏炎性反应和氧化应激来改善脂肪肝。SGLT2改善胰岛素敏感性的大多数假设机制集中在当身体的葡萄糖负荷减少时减少胰岛细胞的胰岛素分泌[7]。随着胰岛素水平的降低,肝脏脂肪酸和胆固醇的合成减少。白色和棕色脂肪组织中的产热增加了能量消耗,减少了巨噬细胞和下游的IL-6水平,脂肪细胞内的炎性损伤得到缓解[8]。

本研究结果还显示,卡格列净药物干预组及糖尿病肾病组尿蛋白含量均高于对照组(P<0.05);卡格列净药物干预组大鼠处死前尿蛋白含量低于糖尿病肾病组(P<0.05),提示卡格列净可降低大鼠的尿蛋白水平,起到一定程度的肾脏保护作用。糖尿病肾病组GLU、BUN、Cr、TC、TG水平高于对照组(P<0.05);卡格列净药物干预组GLU、BUN、Cr、TC、TG水平低于糖尿病肾病组(P<0.05)。提示卡格列净保护肾脏功能同时可降低血脂水平。SGLT2抑制剂可改善胰岛素抵抗,还可通过调节肾小球前后血管张力降低肾小球内高压,从而起到肾脏保护作用。在糖尿病肾病早期,近端肾小管重吸收增加会减少远端输注,导致肾小球反馈功能受损,表现为肾小球传入小动脉扩张和肾小球内压升高。SGLT2抑制剂可增加致密黄斑的溶质和液体输送,从而增加前列腺素的分泌,导致肾小球传出小动脉扩张。其还轻微增加腺苷水平,这可能会轻微增加传入小动脉的阻力,以上因素都降低了肾小球内的压力[9]。SGLT2抑制剂阻断近端肾小管对钠离子的重吸收,增加输送到远端致密斑的钠离子,钠离子通过促进三磷酸腺苷的分解,增加了腺苷产生,进一步降低肾小球内压及改善肾脏高滤过状态,从而恢复受损的球管反馈。DELIGHT试验中,研究显示在给药24周后,达格列净组较安慰剂组的平均UACR水平下降了21%。SGLT2抑制剂降低尿蛋白的作用机制可能与恢复球管反馈、改善肾小球高压有关。随机对照试验的Meta分析显示,SGLT2抑制剂可升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C,平均差值1.93 mg/dl)、降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C,平均差值3.5 mg/dl),降低血清TC(平均差值7.8 mg/dl),其中卡格列净对血脂的影响最大[10]。日本的一项研究报告表明,达格列净给药抑制了致动脉粥样硬化的小密度LDL-C,同时可以增加HDL-C水平[11]。

综上所述,SGLT2抑制剂可降低糖尿病肾病大鼠的血糖水平,减轻肾脏系数,降低尿蛋白排泄,改善糖尿病肾病大鼠的血脂及肾功能水平。该研究结果为糖尿病肾病的防治提供了新的治疗靶点,为SGLT2抑制剂的肾脏保护作用提供了更多的理论依据。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。