不同来源甘草地上部分黄酮类成分含量研究

刘 颖，薄颖异，张 志，侯冰燕，贾 栖，闫滨滨，王文全,4,5，侯俊玲,4*，彭一峰

（1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.天津市宝坻区人民医院 药剂科，天津 301800；3.中国中医科学院中药资源中心，北京 100007；4.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102；5.中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；6.新疆全安药业股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 841000）

甘草为多年生豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch、胀果甘草Glycyrrhiza inflataBat 或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根及根茎[1]。作为我国大宗药材，市场需求量大[2]，其地上部分资源丰富，多种研究表明甘草地上部分中具有多种成分，包括黄酮类、多糖类、生物碱类及氨基酸类等[3-7]。其中，黄酮类成分含量高且具有多种药理作用，如抗炎、抗氧化、降血糖等[8-14]。甘草主要产区有甘肃、内蒙古、新疆等地[15-16]，甘草地上部分的器官主要有叶、茎、花、种子、果实等。对不同产区的甘草地上部分及甘草不同器官中黄酮类成分含量差异的研究尚未有报道，为探究不同产地之间甘草地上部分及甘草不同器官中黄酮类成分含量差异情况，本研究对内蒙古杭锦旗、新疆阿勒泰、甘肃酒泉、吉林白城、陕西绥德五个产区的甘草地上部分及甘草地上部分不同器官中黄酮类成分进行对比分析，以期为甘草地上部分资源的开发利用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

UV-6000PC 型紫外-可见分光光度计（上海佑科仪器有限公司）；KH-500DE 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；CP224C 型电子天平（奥豪斯上海仪器有限公司）；ACchromS6000 型高效液相色谱仪［华谱科技（香港）有限公司］；Agilent SB-C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）（美国安捷伦科技公司）；RE-5023 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；精宏DZF-6050 型真空干燥箱（上海和呈仪器制造有限公司）。

1.2 试药

槲皮素（批号：Y25D551，纯度 ≥ 98%），夏佛塔苷（批号：HA0828XA13，纯度 ≥ 98%），异槲皮苷（批号：P25J9F65872，纯度 ≥ 98%）均购于上海源叶生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher Scientific）；水（娃哈哈集团有限公司）；氢氧化钾和乙醇均为分析纯。

1.3 药材

实验样品为采收于不同产区的栽培品，经中国中医科学院王文全教授鉴定为豆科植物甘草G.uralensis的地上部分，经自然阴干和磨粉机粉碎，过 40 目筛，于常温干燥器内贮存，备用。样品信息见表1。

表1 甘草地上不同样品信息Tab.1 Information on different samples of G.uralensis

2 方法

2.1 甘草地上部分总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素对照品22.20 mg，以少量甲醇溶解，定容于100 mL 棕色容量瓶中，配制成浓度为0.222 mg/mL的对照品溶液，4℃冰箱冷藏保存。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取甘草地上部分粉末5.000 0 g，置于100 mL 锥形瓶中，提取温度75℃，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，超声（功率：500 W）提取30 min，冷却后70%乙醇补足失重，过滤，药渣重复提取一次，合并滤液，摇匀，取续滤液，即得。

2.1.3 标准曲线建立 分别精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 和1.8 mL 的槲皮素对照品溶液于10 mL 容量瓶中，甲醇补足体积至2.0 mL，加入0.1 g/mL 氢氧化钾溶液1.0 mL，充分摇匀，静置5 min，用水定容至刻度，充分摇匀后于400 nm 处测定吸光度值。以吸光度（Y）为纵坐标，槲皮素溶液浓度（X，mg/mL）为横坐标，用Excel 绘制标准曲线[17]，得回归方程Y=19.87X- 0.016 9 （r= 0.999 4）。

2.1.4 含量测定 精密吸取供试品溶液100 μL于10 mL 容量瓶中，用甲醇补足体积至2 mL，加入0.1 g/mL 氢氧化钾溶液1 mL，充分摇匀，静置5 min，加水定容，充分摇匀后于400 nm 波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算供试品溶液中总黄酮含量。

2.2 甘草地上部分黄酮类成分含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取夏佛塔苷、异槲皮苷对照品适量，加70%乙醇制成浓度分别为1.67 mg/mL、1.66 mg/mL 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取甘草地上部分粉末1.000 0 g，置于10 mL 锥形瓶中，提取温度75℃，加入70%乙醇溶液10 mL，超声（功率：500W）提取30 min，70%的乙醇补足失重，摇匀，取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），以乙腈为流动相A，5 mL/L 甲酸水溶液为流动相B，按表2 中的梯度洗脱程序进行洗脱，检测波长为280 nm；柱温为30 ℃；流速为0.8 mL/min；进样量为10 μL[18-19]。

表2 流动相梯度洗脱程序Tab.2 Mobile phase gradient elution conditions

2.2.4 方法学考察 （1）线性关系 精密吸取夏佛塔苷、异槲皮苷混合对照品溶液0.5、1、5、10、20 μL 进行进样，测定峰面积值。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，即得标准曲线：夏佛塔苷为Y= 142 264X+ 66 056（r= 0.999 6）、异槲皮苷为Y= 1371 214.777 8X+ 10 704.677 8（r=0.999 8）。

（2）精密度试验 取样品S2，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下条件，连续进样6 次，记录峰面积，夏佛塔苷、异槲皮苷的RSD 分别为1.88%、1.25%，表明该仪器精密度良好。

（3）重复性试验 取样品S2，按“2.2.1”项下样品制备方法，平行制备6 份供试品溶液，按“2.2.3”项下条件进样，记录峰面积，夏佛塔苷、异槲皮苷的RSD 分别为2.37%、2.56%，表明该方法重复性良好。

（4）稳定性试验 取样品S2，按“2.2.1”样品制备方法制备供试品溶液，取同一份供试品溶液，按“2.2.3”项下条件，分别于0、3、6、12、24、48 h 进样，记录峰面积，夏佛塔苷、异槲皮苷含量的RSD 分别为2.15%、2.32%，表明供试品溶液在48 h 内稳定。

（5）加样回收率试验 取样品S2，精密称定已知含量的甘草地上部分提取物粉末共6 份，分别加入相当于样品成分含量100%的夏佛塔苷和异槲皮苷对照品，按“2.2.1”项下方法制备，依法测定，得到夏佛塔苷和异槲皮苷的平均回收率分别为99.29%、100.13%，RSD 分别为1.18%、1.25%，表明该方法的回收率良好。

2.3 统计学方法

用SPSS 22.0 软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同产地甘草地上部分黄酮成分研究

3.1.1 不同产地黄酮类成分含量 按“2.1.3”项下方法制备供试品并进行检测，结果见表3。本批次样本测量结果中甘肃酒泉样品黄酮含量最高，达到42.81 mg/g，内蒙古杭锦旗次之，为40.33 mg/g，两者差异无统计学意义（P＞0.05），陕西绥德次之，而新疆阿勒泰、吉林白城含量偏低，但也接近30 mg/g。

表3 不同产地甘草地上部分总黄酮含量结果（±s，n = 3）Tab.3 Results of total flavonoid content of G.uralensis in different planting areas（±s，n = 3）

表3 不同产地甘草地上部分总黄酮含量结果（±s，n = 3）Tab.3 Results of total flavonoid content of G.uralensis in different planting areas（±s，n = 3）

注：同列小写字母不同，P ＜0.05。表8 同。

编号产地总黄酮含量/（mg/g）S1新疆阿勒泰27.24 ± 0.42c S2甘肃酒泉42.81 ± 4.75a S3内蒙古杭锦旗40.33 ± 2.06a S4陕西绥德34.16 ± 3.03b S5吉林白城29.96 ± 2.16c F 10.747 P 0.001

3.1.2 不同产地HPLC 共有峰分析 取样品S1 ～S5，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下条件进行HPLC 检测，所得HPLC 图谱见图1。绘制夏佛塔苷、异槲皮苷标准曲线，计算5 个产地中两者的含量，所得结果见表4。其中，不同产地的夏佛塔苷含量差别较大，新疆阿勒泰样品含量最高为2.53 mg/g，甘肃次之，其余产地含量较低；异槲皮苷含量差别不大，主要稳定在1.0 ～ 1.5 mg/g。对其余8个峰峰面积进行比较分析见表5。由图1 可知，新疆阿勒泰样品峰4、峰5、峰6、峰7、峰9 数值缺失；甘肃酒泉样品共有峰数值整体偏高，峰4、峰5、峰6、峰8、峰9 峰面积为五个产区中的最高值；内蒙古杭锦旗样品峰10 数值最高，其余共有峰峰面积均低于甘肃酒泉样品；陕西绥德样品峰7 数值稍高于其余四个产地，其余峰数值与内蒙古杭锦旗样品接近；吉林白城样品峰4、峰5、峰6、峰9、峰10 数值缺失。以上数据表明，不同产地甘草地上部分中成分差异较大，其中，甘肃酒泉样品成分种类较全面且含量较高。

图1 不同产地甘草地上部分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC fingerprint map plot of the aerial parts of G.uralensis in different planting areas

表4 不同产地甘草地上部分定量物质含量分析结果Tab.4 The quantitative analysis results on the content from the aerial parts of G.uralensis in different planting areas

表5 不同产地甘草地上部分共有峰峰面积分析结果Tab.5 The results of the peak areas on the aerial parts of G.uralensis in different planting areas

3.1.3 不同产地共有峰峰面积主成分分析 除上述两个定量成分外，将其余8 个共有峰进行主成分分析，所得各成分因子载荷矩阵见表6，主成分碎石图和载荷图见图2。由图2A 可知前2 个主成分特征值大于1，两者累计贡献率达到86.793%，因此选择前2 个主成分对甘草地上样品质量进行评价[20]。两个主成分特征值及方差贡献值依次降低，其中，第一主成分特征值为5.099，方差贡献值为63.736%；第二主成分特征值为1.845，方差贡献值为23.057%。由表6 和图2B 可知，第一主成分中峰4、峰5、峰6及峰9 系数大，对第一主成分影响大。第二主成分中峰3 是主要决定因子。根据主成分Z1和Z2的贡献率，可以得到主成分组合表达式Z= 0.637 36Z1+ 0.230 57Z2。根据统计学中的 3σ 原则，运用公式Zt=H+Z（本文取H= 3）进行坐标平移以消除负数影响，得到不同产地甘草地上部分样品各自的综合评价得分Zt，结果见表7。由表7 可知，8 个共有峰含量在甘肃酒泉地区最高，新疆阿勒泰地区最低。通过对共有峰半定量分析，结合共有峰的主成分分析数据，共同表明甘肃酒泉黄酮类成分种类较全面且含量较高。

图2 主成分碎石图（A）和载荷图（B）Fig.2 Main component gravel diagram（A）and load diagram（B）

表6 甘草地上部分各成分因子载荷矩阵Tab.6 Component factor load matrix of the aerial parts of G.uralensis

表7 不同产地甘草地上部分样品的主成分因子及综合得分Tab.7 Principal component factors and composite scores of samples of aerial parts of G.uralensis from different planting aeras

3.2 不同器官中黄酮类成分的分析

3.2.1 不同器官中总黄酮含量 以S6 ～ S12 号样品为研究材料，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液并进行紫外检测，所得总黄酮含量结果见表8。其中，叶和花蕾中黄酮类成分含量高，分别为39.12 mg/g 和36.48 mg/g。除叶和花蕾外，其余器官的总黄酮含量均较低。其中，茎的总黄酮含量最低，为3.96 mg/g，叶子和花蕾的总黄酮含量比其高至9 倍。

表8 甘草地上不同器官总黄酮含量结果（±s，n = 3）Tab.8 Results of total flavonoid content of different organs of the aerial parts of G.uralensis（±s，n = 3）

表8 甘草地上不同器官总黄酮含量结果（±s，n = 3）Tab.8 Results of total flavonoid content of different organs of the aerial parts of G.uralensis（±s，n = 3）

编号器官总黄酮含量/（mg/g）S6花蕾 36.48 ± 1.39a S7花 16.38 ± 2.64b S8嫩果 12.42 ± 0.94c S9果实 8.04 ± 0.89d S10种子 6.92 ± 1.07d S11茎 3.96 ± 1.16e S12叶 39.12 ± 2.46a F 226.469 P 0.000

3.2.2 不同器官中HPLC 共有峰成分分析 按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.3”项下方法进行检测，所得HPLC 图谱见图3。按“2.2.4”项下夏佛塔苷及异槲皮苷的回归曲线方法计算不同器官中夏佛塔苷及异槲皮苷的含量，结果见表9，其中甘草叶中夏佛塔苷及异槲皮苷含量均最高，分别为1.95 mg/g 和1.02 mg/g，而花蕾中两者含量仅次于叶，其余含量均较低。对不同器官8 个共有峰峰面积进行比较，结果见表10，其中叶中除峰3 稍低于花、峰6稍低于花蕾外，其余峰峰面积均为所有器官中的最高值；在花蕾中，峰6 数值高于其他器官，峰3 和峰7数值稍低于花，其余峰数值均高于花；花中峰3 数值在所有器官中最高，峰10 缺失；嫩果中10 个峰均低于叶子和花蕾；茎和种子中整体峰数值较低，茎中只含峰6、峰8、峰9，且含量较低，种子中只含峰6、峰7、峰9，含量也较低。以上数据共同表明，在甘草地上部分中，叶所含成分种类及其含量均优于其他器官，甘草叶的利用价值高。

图3 甘草地上不同器官 HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of different organs of the aerial parts of G.uralensis

表9 甘草地上不同器官定量物质含量分析结果Tab.9 The quantitative analysis results on the content from different organs of the aerial parts of G.uralensis

表10 甘草地上不同器官共有峰峰面积结果Tab.10 The results of the peak areas of different organs of the aerial parts of G.uralensis

4 讨论

甘草地上部分含有丰富的黄酮成分，药效价值高，不同产区的气候和土壤环境影响甘草的生长[21-23]，同时也影响着甘草地上部分中黄酮类成分的积累，但目前不同产区对甘草地上部分中黄酮含量的影响相关研究报道较少，本研究通过对不同产地总黄酮含量、指标性成分的定量分析及共有峰的半定量分析，结合共有峰中主成分分析的数据共同探究五个产区甘草地上部分黄酮类成分含量差异。结果表明，各个产地的黄酮类成分种类及含量存在差异，甘肃酒泉样品黄酮类成分种类较全面且含量最高，其黄酮类成分累积量多，内蒙古杭锦旗次之，结合两地的产量，今后可对甘肃酒泉及内蒙古杭锦旗两个产区甘草地上部分进行深入研究；新疆阿勒泰样品总黄酮含量最低，但其夏佛塔苷含量为五个产区中含量最高；陕西绥德、吉林白城样品中异槲皮苷含量高，可作为开发异槲皮苷系列产品的较佳产地。若对甘草地上部分开发利用，考虑到资源利用最大化，建议不对产地进行限制。

甘草地上部分不同器官中黄酮类化合物含量差别较大，其中，甘草叶中黄酮含量高且种类全面，其所含黄酮成分种类及其含量均较优于其他器官，花蕾与之不相上下，但花蕾的采摘对植物留种及后期的生长有着较大的影响，暂不予考虑。由于甘草茎叶为甘草地上部分原材料中主要的组成器官，产量较大，而甘草叶的黄酮含量为茎的9 倍，因此，甘草叶的开发利用价值更高，为提高甘草地上部分整体黄酮纯度，应提高所含叶的纯度，去除较大的粗茎。

5 结论

本研究对五个产区甘草地上部分及其不同器官中黄酮类成分含量进行了对比，揭示了不同产区及不同器官中黄酮类成分含量差异。其中，五个产区中甘肃酒泉样品黄酮含量最高且种类全面，研究价值高，新疆阿勒泰可作为开发利用夏佛塔苷产品的产区。不同器官中叶的黄酮类成分含量最高，利用价值高。通过明确不同产区及不同器官中黄酮类成分含量差异，可为进一步有针对性的利用甘草地上部分资源提供数据支撑，也为后期甘草地上部分的开发利用提供理论依据。