淫羊藿总黄酮提取工艺优化与抗氧化活性研究

王瑜婷，曹 嵌，何荣荣，杨晓静，刘远俊，冯倩仪，孙冬梅

（广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim.或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanumNakai 的干燥叶，性温，味辛、甘，具有祛风湿、补肾阳、强筋骨的功效，常用于治疗阳痿遗精、肾阳虚衰、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛[1]等症。现代研究表明[2-3]，黄酮类成分是其主要活性成分，具有抗肿瘤、调节机体免疫力等作用，对中枢神经系统、免疫系统等均具有广泛的生理活性。

自由基氧化会损伤体内的生物大分子如核酸（DNA、RNA）、酶、蛋白质、糖等，进而对内脏器官、免疫系统造成不良影响[4-6]。据相关文献研究[7]，淫羊藿总黄酮成分具有增强抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化物产生的作用，是一种重要的生物活性成分。本研究拟通过单因素试验筛选出较为重要的影响因子，并采用响应面法优选淫羊藿总黄酮提取工艺，同时对淫羊藿总黄酮进行体外抗氧化活性评价，并与维生素C 的抗氧化活性进行比较，以期为进一步探讨其药理活性和综合利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

UV-2600i 型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；XP26 型百万分之一天平、ME204E 型万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；111B型中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 试药

淫羊藿苷对照品（批号：110737-202017，纯度：98.1%）、维生素C 对照品（批号：100425-202105，纯度：100.0%）均购自中国食品药品检定研究院；DPPH、ABTS 自由基清除能力试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司）；其他试剂均为分析纯；淫羊藿药材（批号：YL2203003，产地：甘肃），经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.的干燥叶，符合2020 年版《中国药典》（一部）淫羊藿项下相关规定。

2 方法与结果

2.1 淫羊藿总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成质量浓度为101.023 4 μg/mL 的溶液，即得。

2.1.2 标准曲线的制备 精密量取“2.1.1”项下对照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、3.0、6.0 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，以70%乙醇为空白，照紫外-可见分光光度法（2020 年版《中国药典》通则0401），在270 nm 波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（X，μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线为Y= 0.036 5X- 0.004 9（2.050 5 ～60.616 4 μg/mL，r=0.999 9）。

2.1.3 含量测定 取淫羊藿粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，超声提取（功率：250 W，频率：45 kHz）30 min，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1 mL，置25 mL 容量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液浓度（μg/mL），并按照下列公式计算总黄酮提取率。

式中，C为供试品溶液中总黄酮浓度（μg/mL）；N为稀释倍数；M为淫羊藿粉末质量（g）。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声温度对总黄酮提取率的影响 固定乙醇浓度为50%，液料比为50 ∶1，超声时间为30 min，超声温度分别设置为30、40、50、60、70、80℃。以超声温度为自变量，总黄酮提取率为因变量绘图，见图1A。由结果可知，随着超声温度的升高，淫羊藿总黄酮提取率略呈下降趋势。可能是由于适宜的温度可以使分子间运动加快[8]，有利于淫羊藿中活性物质溶出；当温度升高时，淫羊藿中总黄酮结构遭到破坏，导致提取率下降。因此后续试验设定超声温度为30℃。

图1 单因素实验结果Fig.1 Results of single factors test

2.2.2 超声时间对总黄酮提取率的影响 固定超声温度为30 ℃，乙醇浓度为50%，液料比为50 ∶1，超声时间分别为20、30、40、50、60 min。以超声时间为自变量，总黄酮提取率为因变量绘图，见图1B。由结果可知，随着超声时间的升高，淫羊藿总黄酮提取率呈现先升高后下降的趋势。可能是由于淫羊藿样品中总黄酮的总量为定值，大部分总黄酮析出后，其含量便不再升高[8]。

2.2.3 液料比对总黄酮提取率的影响 固定超声温度为30℃，乙醇浓度为50%，超声时间为30 min，液料比分别设置为20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1。以液料比为自变量，总黄酮提取率为因变量绘图，见图1C。由结果可知，随着液料比的升高，淫羊藿总黄酮提取率呈现先升高后下降的趋势。可能是由于随着液料比增加，淫羊藿总黄酮溶出增大；随着液料比的继续增大，淫羊藿中的一些其它醇溶性物质溶出也随之增大，从而抑制了总黄酮的溶出[8]。

2.2.4 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响 固定超声温度为30℃，液料比为50 ∶1，超声时间为30 min，乙醇浓度分别设置为40%、50%、60%、70%、80%。以乙醇浓度为自变量，总黄酮提取率为因变量绘图，见图1D。由结果可知，随着乙醇浓度的升高，淫羊藿总黄酮提取率先升高后下降。可能是由于在乙醇浓度较低时，淫羊藿总黄酮没有完全溶出，随着乙醇浓度逐渐增大，淫羊藿中总黄酮的溶出逐渐增多，当乙醇浓度超过70%的时候，提取溶剂极性下降，淫羊藿中其他醇溶性非极性物质溶出量随之增加，从而降低了总黄酮的溶解效果[8]。

2.3 响应面优化试验

2.3.1 试验设计及结果 在单因素实验的基础上，选取超声时间（A）、液料比（B）、乙醇浓度（C）为影响因素，以总黄酮提取率作为响应值，采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件设计三因素三水平的响应面试验，因素与水平见表1，响应面设计及结果见表2。

表1 因素与水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计及结果Tab.2 Experimental design and results

2.3.2 试验结果分析 利用Design-Expert.V8.0.6.1软件对表2 中总黄酮提取率进行二次多元回归拟合，结果见表3。得到二次多项式拟合回归方程：总黄酮得率= 6.60 + 0.014A+ 0.18B- 0.065C+ 5×10-3AB-0.012AC+ 0.012BC- 0.038A2- 0.12B2- 0.16C2。建立的二次多元模型F=14.93，模型P= 0.001 ＜0.01，表明该试验拟合的模型差异具有统计学意义。失拟项P= 0.342 ＞0.05，表明失拟项不显著，未知因素对

表3 拟合回归方程的方差分析结果Tab.3 Analysis of variance results of the fitted regression equation

试验结果干扰较小。总黄酮提取率回归方程的相关系数R2= 0.951 ＞ 0.9，表明可用此模型来分析和预测淫羊藿总黄酮提取率结果[9]。由F值可以看出，各因素对总黄酮提取率影响大小依次是：B＞C＞A，B、B2和C2对总黄酮提取率影响极显著（P＜ 0.01），其余项影响不显著，表明各因素对总黄酮提取率的影响并非简单的线性关系。为了清晰表达两个因素同时对总黄酮提取率的影响，根据回归模型方程，固定任意一个因素的值，考察另外两个因素交互作用对总黄酮提取效果的影响，结果见图2。由结果可知，交互项AB、AC、BC对总黄酮提取率并没有显著的影响，表现为3D 响应面较为平滑，这与方差分析结果基本一致。

图2 响应面试验结果Fig.5 Results of response surface test

2.3.3 工艺验证 采用Design-Expert.V.8.0.6.1 软件，由得到的回归模型计算可得，淫羊藿总黄酮的优化提取工艺为加入47.68 mL 的68.11%乙醇，超声32.65 min，根据生产实际调整为加入50 mL 的70%乙醇，超声30 min，进行三组验证试验，总黄酮提取率分别为6.58%、6.63%、6.60%，均值为6.60%，与预测值6.67%的偏差为1.05%，说明建立的模型预测性良好，优选的淫羊藿总黄酮提取工艺稳定可行。

2.4 抗氧化试验

2.4.1 供试品溶液的制备及测定 取优化条件下的淫羊藿提取液（总黄酮质量浓度为256.043 μg/mL）1.0、2.0、6.0、10.0、12.0、18.0、20.0、25.0 mL 于25 mL 容量瓶内，加70%甲醇定容至刻度，制得总黄酮质量浓度分别为0.010、0.020、0.062、0.102、0.123、0.184、0.205、0.256 mg/mL 的系列样品溶液，分别测定对ABTS 自由基、DPPH 自由基的清除率，并计算淫羊藿提取液的半数抑制浓度（IC50），采用SPSS 26.0 软件中的Probit 方法进行回归分析，拟合后的方程为Probit（P）＝Intercept + Bx（式中，Intercept表示截距，B 表示斜率，P 为自由基清除率，x 为提取液稀释后的总黄酮质量浓度；Probit ＝0.50 时，对应的总黄酮质量浓度即IC50）[10]。同时配制系列浓度的维生素C 溶液作为阳性对照试验，计算IC50。

2.4.2 ABTS 自由基清除试验 ABTS 是一种介质物质，用K2S2O8与ABTS 反映生成稳定的阳离子自由基ABTS+，ABTS+自由基离子的最大吸收波长为734 nm，抗氧化物质与ABTS+反应而使反应体系褪色[11]，A734nm减小，进而对样本中ABTS 清除能力进行定量分析。取ABTS 贮备液和K2S2O8贮备液各1 mL，置于50 mL 容量瓶中，摇匀，避光储存12 ～16 h 后，用无水乙醇定容，即得ABTS 自由基溶液。测定组：移取淫羊藿提取液50 μL 于2 mL 的EP 管中，加入950 μL 的ABTS 自由基溶液，摇匀，室温 （25 ℃）避光静置6 min，测定其吸光度，记为A1；对照组：按上述方法，以等体积的无水乙醇替代ABTS 自由基溶液，测定其吸光度，记为A2；空白组：移取50 μL无水乙醇于2 mL 的EP 管中，加入950 μL 的ABTS溶液，摇匀，室温避光静置6 min，测定其吸光度，记为A0。ABTS 自由基清除率=1-［（A1-A2）/A0］×100%[11-12]，结果见图3。由结果可知，淫羊藿提取液对ABTS 自由基的IC50为0.201 mg/mL，随着总黄酮浓度的升高，ABTS 自由基清除率先升高后趋于平稳，最高仅达50%左右；维生素C 对ABTS 自由基的IC50为0.057 mg/mL，最高清除率趋于100%，说明淫羊藿提取液具有较好的ABTS 自由基清除能力，但弱于维生素C，淫羊藿提取液对ABTS 自由基的清除作用与淫羊藿总黄酮浓度呈正相关性。

图3 不同质量浓度淫羊藿总黄酮和维生素C 对ABTS 自由基的清除率Fig.3 ABTS free radical scavenging rate of total flavonoids and vitamin C in Epimedii Folium at different mass concentrations

2.4.3 DPPH 自由基清除试验 DPPH 法是根据DPPH 自由基有单电子，在517 nm 处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性[13]。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，呈现的颜色越浅，即A值越低，进而对样本中DPPH 清除能力进行定量分析。测定组：移取淫羊藿提取液400 μL 于2 mL 的EP 管中，加入600 μL 的DPPH自由基溶液，摇匀，室温（25 ℃）避光静置30 min，测定其吸光度，记为A1；对照组：按上述方法，以等体积的70%乙醇替代DPPH 自由基溶液，测定其吸光度，记为A2；空白组：移取400 μL70%乙醇于2 mL的EP 管中，加入600 μL 的DPPH 自由基溶液，摇匀，室温避光静置30 min，测定其吸光度，记为A0。DPPH 自由基清除率= 1-［（A1-A2）/A0］×100%[13]，结果见图4。由结果可知，淫羊藿提取液对DPPH 自由基的IC50为0.133 mg/mL，随着总黄酮浓度的升高，DPPH 自由基清除率逐渐增大，浓度达到较高值时清除率可接近100%；维生素C 对DPPH 自由基的IC50为0.027 mg/mL，最高清除率趋于100%，说明淫羊藿提取液具有较好的DPPH 自由基清除能力，但弱于维生素C，淫羊藿提取液对DPPH 自由基的清除作用与淫羊藿总黄酮浓度呈正相关性。

图4 不同质量浓度淫羊藿总黄酮和维生素C 对DPPH 自由基的清除率Fig.4 DPPH free radical scavenging rate of total flavonoids and vitamin C in Epimedii Folium at different mass concentrations

3 讨论

黄酮类化合物广泛分布于自然界中，具有明显的生物活性及重要的研发价值。本研究基于单因素试验，设计响应面法优化得到淫羊藿总黄酮提取工艺∶乙醇浓度为70%，液料比为50 ∶1，超声时间为30 min。此条件下，总黄酮实际提取率为6.60%，与预测值接近，表明优选的工艺稳定可靠。

现代研究表明，自由基氧化造成的损伤能够诱发许多疾病。DPPH 法和ABTS 法已经开始广泛应用于定量测定食品药品的抗氧化能力，并具有典型性[14]。抗氧化活性试验结果显示，淫羊藿总黄酮对ABTS 自由基的IC50为0.201 mg/mL，但清除率最高仅在50%左右，而后随着总黄酮浓度升高，ABTS 自由基清除率趋于平稳；淫羊藿总黄酮对DPPH 自由基的IC50为0.133 mg/mL，随着总黄酮浓度的升高，DPPH 自由基清除率逐渐上升，可趋于100%，表明淫羊藿总黄酮具有较强的自由基清除能力。

4 结论

本研究优化了淫羊藿总黄酮的提取工艺，优选工艺稳定、可靠，抗氧化试验结果表明淫羊藿总黄酮具有较强的自由基清除能力，为淫羊藿总黄酮的开发利用提供了一定的参考价值。淫羊藿中不仅有黄酮类成分，还含有丰富的多糖类、木脂素类及生物碱类等成分，后续可对淫羊藿其他成分进行体外抗氧化活性评价，为淫羊藿的开发应用提供依据。