外源复合酶制剂对发酵后茄芯烟叶品质的影响

琚绍煊，时向东，王骏，王俊，刘路路，蔡兴华，郭文龙，丁松爽

(1. 河南农业大学烟草行业栽培重点实验室，河南郑州 450002；2. 浙江中烟工业有限责任公司技术中心，浙江杭州 310024；3. 四川省烟草公司德阳市公司，四川德阳 618400；4. 四川中烟工业有限责任公司长城雪茄厂，四川德阳 618400)

茄芯是决定雪茄抽吸时吃味和香气风格特征[1]的核心部分，对烟叶香气风格、吃味、强度和劲头等方面有较高要求[2]，但目前我国生产的茄芯烟叶多数缺乏浓郁香气[3]。 而在烟叶发酵过程中，添加外源酶制剂不仅可以调控烟叶的内在化学成分，降低烟碱含量，改善烟叶因栽培和调制措施不当造成的品质不足[4－6]，使烟叶香气量明显增加，减轻烟叶的杂气和刺激性[7]，令吃味趋于醇和、干净，烟叶总体质量得到提高，还可以加速烟叶的发酵进程，缩短烟叶发酵周期[8]。

在工业发酵中常用果胶酶、纤维素酶和蛋白酶等作为外源酶制剂。 胡捷等[9]在雪茄烟叶发酵过程中添加果胶酶，得到的雪茄烟叶苦味明显改善，总体品质提高。 经纤维素酶处理的上部烟叶香气质增加，杂气和刺激性降低，感官品质提高[10，11]。 寇明钰等[12]用中性蛋白酶处理的雪茄烟叶化学成分更加协调，感官质量得到改善。 郑霖霖等[13]对雪茄茄芯烟叶喷施果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶进行发酵，结果烟叶化学成分协调性得到改善，感官品质得以提高。

酶具有专一性，对所作用的底物有严格的选择性。 一种酶只能催化某一类甚至只催化某一种化学物质发生反应。 研究认为烟叶发酵过程由多种酶共同催化作用[14，15]。 近年来，关于烤烟添加外源酶制剂来改善烟叶品质的研究较多，但是关于添加外源复合酶制剂改善雪茄烟叶品质的研究鲜有报道。 为此，本试验以德雪3 号上部一级未发酵的茄芯烟叶为材料，研究雪茄烟叶发酵过程中添加外源复合酶制剂对发酵后茄芯烟叶品质的影响，以期筛选出改善其品质的外源复合酶制剂，继而提高雪茄烟品质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为2020 年调制后的雪茄品种德雪3 号上部一级未发酵的茄芯烟叶，由四川中烟工业有限责任公司长城雪茄厂提供。 所用外源酶试剂:纤维素酶(10 000 U/g，上海麦克林生化科技有限公司产品)、果胶酶(30 000 U/g，上海麦克林生化科技有限公司产品)、中性蛋白酶(200 000 U/g，索莱宝生物科技有限公司产品)。

1.2 试验设计与处理方法

试验设计见表1，共8 个处理。 将不同外源酶制剂按试验设计比例混合并溶于水，然后均匀喷施在调制后的雪茄烟上部叶表面，并以喷施同等体积的蒸馏水作对照，使平均回潮含水率30%左右，平衡水分24 h。 之后于2021 年7—8 月在四川省烟草公司德阳市公司进行人工堆积发酵，烟堆长1.86 m、宽2.0 m、高1.35 m，将处理的样品放在烟堆中间位置。 在烟堆0.4、0.7、1.0 m 高度的平面中心位置放入精创GSP－6 温湿度自动记录仪，当垛心温度显示达到50℃时，按照上翻下、外翻内的原则进行烟叶翻堆并重新堆垛。 整个发酵过程进行30 d、4 次翻堆，发酵环境温度27 ～33℃、湿度68%～75%。 发酵结束后的指标测定和感官质量评价采用半叶法:取完整叶片的一半于40℃下烘干，研磨过60 目筛保存，用于化学成分和中性致香物质成分的测定；取另一半烟叶手工卷制成雪茄，用于感官质量评价。 每处理重复3 次。

表1 试验设计

1.3 测定项目及方法

1.3.1 常规化学成分测定 参照YC/T 159—2002[16]、 YC/T 161—2002[17]、 YC/T 249—2008[18]、YC/T 468—2013[19]的方法分别测定烟叶总糖、还原糖、总氮、蛋白质和烟碱含量(质量分数)。

1.3.2 中性致香物质测定 香气物质提取及定性定量分析采用HP5890－5972 气相色谱质谱仪。在同时蒸馏萃取装置的一端接盛有20 g 烟样(过60 目筛)、2 g 柠檬酸、600 mL 蒸馏水的1 000 mL圆底烧瓶，使用恒温电热套进行加热；装置的另一端接盛有40 mL 二氯甲烷和1 mL 内标的250 mL圆底烧瓶，该端烧瓶置于恒温水浴锅中加热，水浴温度为60℃。 同时蒸馏萃取2.5 h。 萃取完成后，加入10 g 左右无水硫酸钠干燥有机相，然后于60℃水浴中浓缩至1 mL 左右即得烟叶精油。 将提取液由GC/MS 鉴定结果和NIST 库检索定性。

1.3.3 感官质量分析 将发酵后的另一半烟叶样品手工卷制成长度110 mm、直径14 mm 的雪茄烟支，置于温度18℃、相对湿度70%的Binder恒温恒湿箱中醇化养护4 个月供评吸使用。 评吸由河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地组织国内雪茄工业企业有关专家完成。 评价方法采用湖北中烟三峡卷烟厂9 分制标准，对烟叶香气质、香气量、余味、杂气、甜润感、刺激性、燃烧性、灰色8 个指标进行感官质量评价，满分100分。 按下式计算总分，总分越高代表烟叶感官质量越好。

式中:T 为感官质量评价得分；Pi为某单项指标权重(香气质18%、香气量16%、余味16%、杂气10%、甜润感10%、刺激性12%、燃烧性10%和灰色8%)，为某单项指标平均得分。 评价标准如表2 所示。

表2 雪茄烟叶感官质量评价标准

1.4 数据处理与分析

利用Microsoft Excel 2019 对样品常规化学成分变化趋势、中性致香物质含量和感官质量评价得分进行图表制作；利用IBM SPSS Statistics 21软件对样品的化学成分进行多重比较，并对外源复合酶制剂用量与常规化学成分和中性致香物质进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 外源复合酶制剂对茄芯烟叶发酵后常规化学成分含量的影响

由图1 可知，外源酶制剂处理下发酵后烟叶总氮含量有所增加，各处理总氮含量均显著高于CK，NC 处理烟叶总氮含量随着纤维素酶浓度的增加呈上升趋势。 各处理发酵后烟叶蛋白质含量均降低，说明添加外源中性蛋白酶可以有效降低发酵后烟叶蛋白质含量，其中NC2 处理烟叶蛋白质含量最低，较CK 下降18.09%，达显著水平。各处理发酵后烟叶烟碱含量均有所下降，N 处理与CK 无显著差异；NP 处理中，NP1 处理烟叶烟碱含量显著低于N 处理，NP2、NP3 与N 处理无显著差异，表明外源复合酶制剂中低浓度果胶酶可以降低发酵后烟叶中的烟碱含量；NC1、NC2、NC3 处理烟叶烟碱含量均显著低于N 处理，其中NC2 处理最低，为1.96%

图1 不同处理发酵后茄芯烟叶总氮、蛋白质和烟碱含量

由图2 可知，经外源复合酶制剂处理后烟叶总糖和还原糖含量均有所上升，且相同外源酶制剂处理的茄芯烟叶发酵后还原糖与总糖含量变化趋势基本一致。 NP、NC 处理烟叶总糖和还原糖含量均随着果胶酶和纤维素酶浓度的增加而增加。 所有处理中NC3 总糖、还原糖含量显著高于其它处理，表明外源复合酶制剂中纤维素酶浓度越大，发酵后烟叶总糖和还原糖含量越高。

图2 不同处理发酵后茄芯烟叶总糖和还原糖含量

2.2 外源复合酶制剂对发酵后烟叶中性致香物质含量的影响

各处理发酵后茄芯烟叶共检测出26 种对烟叶香气成分有较大影响的中性致香物质，其中棕色化反应产物5 种、苯丙氨酸转化产物4 种、类胡萝卜素降解产物15 种、西柏烷类降解产物1 种和叶绿素降解产物1 种。

2.2.1 对叶绿素降解产物和西柏烷类降解产物的影响 测得的26 种中性致香物质中，叶绿素降解产物新植二烯的含量最高。 新植二烯可以增加烟的吃味和香气，进入烟气时具有减少刺激和醇和香气的作用[21]。 由表3 可知，各处理发酵后烟叶新植二烯含量均高于CK，且所有处理中新植二烯含量最低的是NP2 处理，NC 处理中纤维素酶浓度越大烟叶新植二烯含量越高，最高达332.23 μg/g，比CK 增加167.16%。 表明，烟叶喷施外源酶制剂可以增加发酵后烟叶新植二烯含量，且除NP2 外其它复合酶制剂处理烟叶新植二烯含量均高于单酶制剂处理，以纤维素酶和中性蛋白酶复合酶制剂处理效果较好。

表3 不同处理发酵后雪茄烟叶的叶绿素降解产物及西柏烷类降解产物含量(μg/g)

西柏烷类降解产物茄酮是烟草中含量最为丰富的中性香味物质之一，具有特别的香味。 NC3处理发酵后烟叶茄酮含量最高，达到28.84 μg/g。

2.2.2 对类胡萝卜素降解产物含量的影响 类胡萝卜素降解产物中β－大马酮、β－二氢大马酮等高沸点酮类物质具有明显的致香作用[22]。 由表4 可知，除β－环柠檬醛外，各处理烟叶各种类胡萝卜素降解产物含量均比CK 明显增加。 其中NC3 处理法尼基丙酮含量增幅最大(92.55%)，β－大马酮含量最高，达到3.09 μg/g；烟叶β－二氢大马酮含量N 处理只有3.22 μg/g，低于其它外源复合酶制剂处理，NP1 处理含量最高，为4.82 μg/g。 从总量看，外源酶制剂处理发酵后烟叶类胡萝卜素降解产物含量均有所升高，NP1 处理与CK 相比增幅最大，而NP2 增幅较小，仅有45.76%。 由此可见，150 U/g 中性蛋白酶和90 U/g 果胶酶复合制剂对类胡萝卜素降解产物总量的影响较大。

表4 不同处理发酵后雪茄烟叶的类胡萝卜素降解产物含量(μg/g)

2.2.3 对苯丙氨酸转化产物含量的影响 由表5可知，4 类苯丙氨酸转化产物中苯乙醇含量最高，且在所有处理中NP1 含量最高，达到8.89 μg/g，较CK 增加184.03%。 除苯乙醇外，苯甲醇也具有明显的增香作用，已用于烟草加香[22]。 处理后的烟叶，苯甲醇增幅最大达到208.13%(NP1)。总体来说，外源复合酶制剂处理烟叶苯丙氨酸转化产物总量均高于单酶制剂处理，其中NP1 处理含量最高，为23.20 μg/g。

表5 不同处理发酵后雪茄烟叶的苯丙氨酸转化产物含量(μg/g)

2.2.4 对棕色化反应产物含量的影响 棕色化反应产物含有许多优质烟草的致香成分[23]。 由表6 可知，NC 处理中随纤维素酶浓度增加，烟叶糠醛含量呈上升趋势，最高达9.07 μg/g；各处理烟叶糠醇含量与CK 相比均有所升高，且NP、NC处理烟叶糠醇含量高于N 处理。 总体来说，外源酶制剂处理发酵后烟叶棕色化反应产物总量增加，且外源复合酶制剂处理高于中性蛋白酶处理。这可能是因为果胶酶和纤维素酶将烟叶中的果胶和纤维素降解为还原糖，与中性蛋白酶降解蛋白质产生的氨基酸结合，发生棕色化反应，使烟叶棕色化反应产物含量增加。

表6 不同处理发酵后雪茄烟叶的棕色化反应产物含量(μg/g)

2.3 发酵后雪茄烟叶内在品质指标的主成分分析

对测得的26 种中性致香物质和总糖、还原糖、总氮、蛋白质和烟碱5 种常规化学成分进行主成分分析[24]，提取特征值大于1 的主成分，得到4个主成分(表7)。 可知，4 个主成分的方差贡献率分别是74.703%、9.445%、6.215%和3.897%，累积方差贡献率达到94.261%，即代表其总信息的94.261%。 这样就能保留烟叶大部分香气成分和常规化学成分指标的绝大部分信息，将原来的31个品质指标转化为4 个不相关的综合指标，达到了降维的目的。

表7 特征值与累积贡献率

表8 为前4 个主成分的载荷矩阵。 可以看出，第一主成分PC1 的方差贡献率为74.703%(表7)，主要以巨豆三烯酮2、芳樟醇、β－二氢大马酮、法尼基丙酮等类胡罗卜素降解产物的影响为主；第二主成分PC2 的方差贡献率为9.445%，主要以烟叶常规化学成分中蛋白质含量的影响为主；第三主成分PC3 和第四主成分PC4 的方差贡献率分别为6.215%、3.897%，主要以总糖、还原糖和茄酮的影响为主。 总的来说，PC1 和PC2 对烟叶内在品质的贡献较大， 累积贡献率达到84.148%。

表8 主成分的载荷矩阵

由表9 可知，NP1 处理(150 U/g 中性蛋白酶和果胶酶90 U/g)发酵后烟叶主成分综合得分最高，烟叶综合品质最优，其次为NC3 处理(150 U/g中性蛋白酶和150 U/g 纤维素酶)，这与感官质量评价结果一致。

表9 不同处理烟叶主成分得分

2.4 外源复合酶制剂处理发酵后烟叶的感官质量评价

将堆垛发酵后的烟叶进行评吸，感官质量评价结果如图3。 可知，外源酶制剂处理发酵后烟叶的香气质提升，香气量增加，杂气减少，刺激性有所下降，甜润感增加。 其中NP1、NP3、NC3 处理发酵后烟叶的香气质均优于其它处理，NP1、NC3 处理烟叶刺激性明显下降。 NC3 处理香气质稍好，香气量尚充足，刺激性、杂气均小于其它处理，感官质量综合评价最高。

图3 不同处理发酵后茄芯烟叶感官质量评价得分图

3 讨论

烟叶经酶促发酵处理，能有效引起烟叶常规化学成分的变化[8]。 有研究表明，外源酶制剂处理可以促进烟叶总氮的降解[20]。 本研究中，添加外源复合酶制剂处理发酵后茄芯烟叶总氮含量与对照相比有所上升，与前人研究结果相悖，这可能与酶本身就含氮及酶制剂喷施激活氮代谢相关酶活性等[10]有关。 烟叶喷施中性蛋白酶制剂可有效降解烟叶蛋白质含量[13，25]，烟叶喷施外源酶制剂可以增加烟叶总糖、还原糖含量[26－29]。 本研究中，果胶酶和纤维素酶与中性蛋白酶的复合酶制剂处理其烟叶发酵后总糖、还原糖含量增加，这与李晓等[30]用果胶酶、纤维素酶单独处理效果一致。 此外，复合酶制剂处理的发酵后烟叶烟碱含量有所下降，与吴薇等[10]的研究结果相同，这可能是因为烟叶喷施酶制剂影响到烟碱代谢相关酶的活性，进而促进烟碱降解。

本试验共提取出26 种中性致香物质，其中含量最高的是叶绿素降解产物新植二烯，其次是类胡萝卜素降解产物，与郭文龙等[31]测得的结果一致。 经外源复合酶制剂处理的发酵后烟叶棕色化反应产物、类胡萝卜素降解产物和苯丙氨酸转化产物含量增加，这与于建军等[27]的研究结果一致。 其原因可能是:外源复合酶制剂在烟叶发酵过程中促进蛋白质的降解，生成游离的氨基酸、短肽等小分子物质，参与棕色化反应而生成致香物质[32]；此外，某些具有特殊结构的多肽链可能增加类胡萝卜素与氧气分子的碰撞几率，从而促进类胡萝卜素的氧化降解，生成致香物质[33]；并且，外源复合酶制剂可以使烟叶中的果胶质和纤维素降解，产生还原糖类物质，增加参与棕色化反应的底物，还可以加速苯丙氨酸的代谢，使苯甲醇、苯乙醇等致香成分含量显著升高。 经外源复合酶制剂处理的发酵后烟叶中性致香物质总量明显增加，这可能是因为不同酶共同作用，促进烟叶中的大分子物质分解，加速各种酶促反应，从而导致致香物质的前体物转化和积累[26，34]。

主成分分析是通过将单位不同的原始数据进行标准化，使其各项指标数量级保持一致，再将这些信息重叠的指标通过少数几个主要指标反映出来，进而对这些指标进行综合评判[35]。 本研究中，主成分综合评价的结果与各处理感官质量评价排名结果基本一致，表明主成分分析可以应用于外源复合酶制剂处理发酵后烟叶质量的评价。

从本研究结果推测得出，可以结合不同烟叶自身的情况和不同复合酶制剂对烟叶感官质量的影响来选择复合酶制剂，也可以根据不同酶制剂对不同化学成分、不同中性致香物质含量的影响选择不同的复合酶制剂，以便有针对性地改善烟叶化学成分和提高烟叶的中性致香物质含量，从而改善烟叶的感官品质，提高烟叶质量。 但是，酶制剂均为蛋白质溶液，本身也受温度、湿度、pH 等条件的影响[10]，因此，发酵环境是否为酶制剂的最佳反应环境、如何设定反应条件使各种酶充分发挥作用、工业上对大量烟叶处理时如何降低外源酶制剂的成本等问题仍需要继续探究。 此外，烟叶在堆积发酵过程中存在微生物、酶与氧气及氧自由基的共同作用，从而产生协调烟叶内在化学成分、改善烟叶感官评吸质量的效果。 添加酶制剂仅仅是改善其中一种影响因素，关于发酵过程中微生物、氧自由基的作用对烟叶品质的影响还需要进一步研究。

4 结论

添加外源复合酶制剂有利于发酵后雪茄茄芯烟叶蛋白质降解和转化，提高中性致香物质含量。主成分分析结果显示，外源添加150 U/g 中性蛋白酶和90 U/g 果胶酶复合制剂处理(NP1)发酵后烟叶综合品质得分最高，其次为NC3 处理(150 U/g 中性蛋白酶和150 U/g 纤维素酶)。 感官质量评价NC3 处理总得分最高，最有利于提高发酵后茄芯烟叶品质。