基于Netrin-1介导神经萌发探讨温经活血外治法对膝骨关节炎大鼠疼痛的影响

马振源,魏义保,廖太阳,黄正泉,茆军,王培民

(南京中医药大学附属医院/江苏省中医院,江苏 南京 210029)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一种好发于中老年人群以膝关节疼痛、僵硬、畸形为主要临床表现的常见的退行性骨关节疾病[1]。流行病学研究显示,自20世纪90年代以来,世界上KOA的发病率随着人口老龄化持续增长,其中65%以上的患者均以疼痛为主要症状,给生活带来了极大的不便[2-4]。因此,有效地降低KOA患者的疼痛对提高患者生活质量有着重要的意义。

研究表明疼痛致敏在KOA相关疼痛中起着重要作用[5],且与感觉神经支配的神经纤维密度密切相关[6-7]。轴突导向因子Netrin-1是众多轴突导向因子家族中研究最多的,它参与了调控机体的感觉神经萌发,是具有导向性的一类导向因子[8]。研究表明Netrin-1与神经元表面受体结直肠癌缺失基因(Deleted in colorectal cancer,DCC)或非协调同源-5(Uncoordinated-5,UNC5)的结合,实现对感觉神经萌发的导向性调控。其中,Netrin-1/DCC对神经元轴突具有吸引作用,引导神经纤维向受损位置生长,改变神经纤维的密度进而影响信息传递的强度;而Netrin-1/UNC5却更多地表现出排斥作用。Netrin-1在KOA疼痛领域中具有得巨大研究价值和潜力[9-12]。

温经活血外治法代表方“易层”贴敷是南京中医药大学附属医院诸方受教授在继承传统中医贴敷疗法基础上,研制出的一种新的中医外治法技术[13]。前期研究表明温经活血外治法对KOA疼痛具有良好疗效,但具体机制尚未阐明[14-15]。本实验拟通过探讨温经活血外治法对Netrin-1、神经萌发指标和疼痛介质的作用,发现潜藏的机制,为缓解KOA疼痛提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 动物与分组

实验选用4月龄健康的SPF级SD雄大鼠共30只,体质量180～240 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物生产许可证号:SCXK(京)2021-0011,所有动物饲养于南京中医药大学实验动物中心(动物伦理号:202208A032)。

将30只大鼠随机分为空白组、模型组、外治法组,每组各10只。大鼠适应性饲养1周后,空白组不作任何干预,模型组使用前交叉韧带横断术(Anterior cruciate ligament transection,ACLT)造模处理无需药物干预,外治法组行ACLT造模14 d后采用温经活血外治法药物贴敷28 d。

1.2 实验药物准备

“易层”贴敷购自江苏省中医院,由三色散和复方三黄油膏组成,所用的中药材均符合《中国药典》要求,所有药物于4 ℃环境中保存。

1.3 造模方法

所有大鼠适应性饲养1周后,空白组不做任何处理,模型组、外治法组大鼠,用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,膝关节备皮消毒,自膝关节外侧切开至关节腔,离断前交叉韧带,行抽屉试验阳性后逐层缝合,造模后将大鼠放回笼中,关节不固定,让其自由活动。动物房室温维持在(25±2)℃,相对湿度控制在(60±5)%,每天日照/夜晚为12 h轮替。

1.4 给药方法

造模14 d后开始用药。膝关节备皮后,皮肤表面均匀涂抹[16]温经活血外治法膏药,每天贴敷8 h,共贴敷28 d。使用独特设计的乐扣杯[17],诱使大鼠进入杯中,将鼠尾置于杯外,底部钻出多个中型孔洞,方便大鼠饮水,保持通气性,保证给药后的大鼠舔舐不到膝关节所涂抹的外治药膏,8 h后再取出大鼠置于笼中正常饲养。

1.5 组织样本提取和保存方法

给药干预28 d后,使用配置好的3%戊巴比妥钠(Sigma公司)腹腔注射麻醉各组大鼠,剖开腹部,将腹腔内脏翻至一侧,找到腹主动脉后采血至采血管中,静置,离心后-80 ℃冻存;大鼠背部备皮,剥离腰段脊柱,沿着矢状位剪开脊柱,循神经根走形寻找并提取L3～L5背根神经节(Dorasal root ganglion,DRG)组织;大鼠膝关节备皮,自髌韧带两侧切开后,再横向切开股四头肌远端,向远端翻折髌骨及韧带,取下髌韧带上滑膜组织。每组随机选取3只大鼠滑膜组织和DRG组织放入事先准备好的含有4%多聚甲醛的冻存管中保存,以备病理切片,其余放入对应的冻存管,-80 ℃保存。

1.6 HE染色和镀银染色

将4%多聚甲醛固定的滑膜,用石蜡包埋,切片,滑膜组织常规HE染色,镜下摄片;用石蜡包埋,切片,水洗,银染,固定,封固等,依据神经纤维染色试剂盒说明书进行,镜下摄片。

1.7 ELISA法检测血清中炎性及疼痛标志物

在众多病理性疼痛的研究中降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)是观察疼痛敏感性的关键指标[18];P物质(Substance P,SP)是广泛分布于细神经纤维内的一种神经肽,且与痛觉传递密切相关[19]。这两者是常见的疼痛相关标志物。而白介素-6(Interleukin 6,IL-6)则作为临床上常见的促炎因子,其在血清中的含量被作为评价机体炎症反应的指标之一[20]。本研究分别依据大鼠IL-6(检测范围:0.25～8 ng·mL-1)、SP(检测范围:5～160 pg·mL-1)和CGRP(检测范围:1.25～40 pg·mL-1) ELISA检测试剂盒(购自金益佰公司)说明书进行以下步骤检测:标准、空白每孔加入50 μL,样本孔中每孔加入10 μL(40 μL样本稀释液);每孔加入酶标试剂100 μL,空白孔除外,后盖上封板膜,至37 ℃孵育60 min;在孵育过程中将洗涤液配好,将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用;每孔加入250～300 μL的洗涤液,将板子平放在桌子上晃动5 s,然后静置30 s,甩干,拍板;然后每孔中依次加入显色A液50 μL,显色B液50 μL避光37 ℃显色15 min后,每孔加入50 μL的终止液。以空白孔调零,450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

1.8 Western blot检测Netrin-1、DCC、UNC5、CGRP蛋白表达

提取滑膜组织和DRG组织总蛋白:滑膜组织和DRG组织自-80 ℃中取出,剪碎研磨成粉,后按说明书要求加入400 μL RIPA裂解液(购自上海碧云天生物技术有限公司)裂解,继续研磨10～15 min,再于冰上静置30 min后离心取上清,按BCA蛋白测定试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)说明书测定各组织蛋白浓度,后将配平的组织蛋白置于98 ℃变性5 min。取样化冻并离心,制胶,上样,电泳,转膜至PVDF膜,再用5%脱脂奶粉室温封闭2 h,封闭完成后用1×TBST洗膜3次,每次10 min,后加入一抗:Netrin-1(DF8579,affinity公司)、DCC(DF3611,affinity公司)、UNC5(DF13685,affinity公司)、CGRP(df7386,affinity公司)、β-actin(ab8227,美国Abcam公司),4 ℃孵育过夜,次日1×TBST洗涤3次,每次10 min,二抗(羊抗兔二抗,ab205718,美国Abcam公司)室温孵育2 h,ECL显色曝光。以β-actin作为内参,分析灰度值,计算灰度系数=(目标蛋白的面积×灰度值)/(β-actin的面积×灰度值)取样。

1.9 qPCR检测Netrin-1、DCC、UNC5、CGRP基因表达

按Trizol法说明书进行滑膜组织和DRG组织总RNA提取,并测定各组RNA吸光度。逆转录后按照SYBR qPCR mix说明书操作,qPCR结果以β-actin为内参进行半定量计算,采用2-ΔΔCt计算法,即(ΔCt=样本Ct值-内参Ct值)对目的基因的相对表达量进行数据分析。引物设计如表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.10 大鼠冷板抬爪实验

将各组大鼠在第0、14、28、42天置于提前设定好的温度为0 ℃的可调温金属板上,透明罩子罩住后,通过可调温金属板系统(35150-001,意大利Ugo Basil SLR)监测大鼠在冷板上的抬爪时间并记录。

1.11 统计学方法

对各组所得的实验数据进行统计分析,使用Graphpad Prism 8.0软件统计分析并绘制柱状图,各组间均采用单因素方差法分析,其中P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠滑膜组织HE染色

倒置显微镜观察滑膜组织HE染色切片,空白组滑膜细胞有序分布,几乎无炎性细胞浸润;KOA组中炎性细胞浸润明显增加,滑膜细胞大量增生,并且排列不规则,呈重度滑膜炎病理改变;外治法组中炎性细胞浸润相比于KOA组明显减少。见图1。

图1 滑膜组织HE染色切片(×200)Fig.1 HE staining sections of synovial tissue(× 200)

2.2 大鼠滑膜组织神经镀银染色

倒置显微镜观察滑膜组织神经镀银染色切片,空白组滑膜细胞和神经纤维表达量少;KOA组中滑膜细胞大量增生,且神经纤维数量和表达量明显上升,呈严重的滑膜纤维化及感觉神经萌发改变;外治法组相比于KOA组滑膜细胞明显减少,且神经纤维数量和表达量也明显减少。见图2。

图2 滑膜组织神经镀银染色切片(×200)Fig.2 Nerve silver staining sections of synovial tissue(× 200)

2.3 大鼠血清中促炎因子和疼痛因子含量的变化

KOA组中促炎因子IL-6的表达量相比于空白组有了明显增多的趋势,而外治法组相比于KOA组则减少趋势明显;同时,KOA组大鼠血清中疼痛介质SP和CGRP的表达量相比于空白组也有了明显的增加趋势,外治法组则相比于KOA组有了明显的减少趋势。见图3。

注:与空白组比较,**P<0.01;与KOA组比较,图3 各组大鼠血清中促炎因子IL-6和疼痛因子SP、CGRP含量Fig.3 Levels of pro-inflammatory factor IL-6 and pain mediator SP and CGRP in the serum of rats in each group

2.4 大鼠冷板抬爪时间

与空白组相比,KOA组和外治法组在第14天冷板抬爪时间有了明显的缩短,KOA组直至末次给药的第42天抬爪时间的波动都较为平缓,而外治法组则在开始给药后抬爪时间在缓慢延长,趋近于空白组。见图4。

图4 各组大鼠不同时间冷板抬爪时间Fig.4 Cold plate paw lifting time for each group of rats at different time

2.5 各组大鼠滑膜组织Netrin-1、CGRP蛋白和基因的表达量

Netrin-1、CGRP蛋白在KOA组相比于空白组表达明显增加(P<0.01),外治法组较KOA组的表达则明显减少(P<0.01);同时KOA组滑膜组织中Netrin-1的基因表达相比于空白组明显增加(P<0.05),外治法组相比于KOA组中Netrin-1的基因表达则明显减少(P<0.01);KOA组滑膜组织中CGRP的基因表达相比于空白组则明显增加(P<0.05),外治法组相比于KOA组则明显减少(P<0.01)。见图5。

注:与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01;与KOA组比较,图5 各组大鼠滑膜组织Netrin-1、CGRP相对蛋白和基因表达比较Fig.5 Comparison of relative protein and gene expression of Netrin-1 and CGRP in synovial tissue of rats in each group

2.6 各组大鼠DRG组织DCC、UNC5蛋白和基因表达量

DCC蛋白在KOA组相比于空白组表达明显增加(P<0.01),外治法组较KOA组的表达则明显减少(P<0.01);UNC5蛋白在KOA组相比于空白组表达明显减少(P<0.01),外治法组较KOA组的表达则明显增加(P<0.01)。KOA组DRG组织中DCC的基因表达相比于空白组明显增加(P<0.05),外治法组相比于KOA组中DCC的基因表达则明显减少(P<0.05);而KOA组DRG组织中UNC5的表达相比于空白组则减少,外治法组相比于KOA组中UNC5的表达则增加。见图6。

注:与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01;与KOA组比较,图6 各组大鼠滑DRG组织DCC、UNC5相对蛋白和基因表达比较Fig.6 Comparison of relative protein and gene expression of DCC and UNC5 in the smooth DRG tissue of rats in each group

3 讨论

KOA在中国传统医学范畴中属于“痹症”,根据其病因病机“不通则痛,不荣则痛”可以将本病分为虚实两证,而疼痛则贯穿整个疾病过程,因此缓解疼痛成为了减轻KOA患者痛苦的首要需求。在中医方面,温经活血外治法代表方——“易层”贴敷正是以温经活血立法,可以有效地针对因不通和不荣所导致的KOA疼痛,且在临床实验中得到了验证。我们大量的前期研究表明温经活血外治法不仅能延缓在KOA早期出现的滑膜炎,还可以缓解KOA患者疼痛感受,极大地改善患者的生活质量[21]。在前期研究中,我们对“易层”贴敷的有效成分进行了代谢组学分析,从中检测出大量的有效化合物[22]。有趣的是文献中也报道这些有效化合物对多类疾病的疼痛均具有缓解的效果,如:温经活血汤加减联合壮医药线点灸治疗子宫腺肌病慢性疼痛疗效肯定,可明显缓解痛经症状,缩短痛经及排卵痛持续时间[23];当归通过改善血液流变学、调节神经内分泌激素、降低钙离子、免疫调节等途径达到缓解原发性痛经的效果[24];姜黄素可以显著减轻KOA大鼠膝关节的痛觉过敏和软骨退变,其作用机制可能与减少IL-1β、TNF-α,单核细胞趋化蛋白-1的含量及恢复软骨代谢平衡有关[25];香草酸可以显著减少KOA大鼠滑膜炎症和疼痛因子CGRP、TrkA的表达[26];在白杨素的干预下,KOA大鼠滑膜炎症和膝关节疼痛症状明显改善,同时还降低了相关炎性因子和疼痛因子的表达[27]。

本研究的结果显示温经活血外治法能够显著减轻KOA大鼠疼痛,抑制血清中促炎因子IL-6和疼痛介质SP、CGRP的表达,缓解了膝关节滑膜炎症。同时,我们还观察到在KOA组滑膜组织中轴突导向因子Netrin-1的表达相比于空白组明显增加,而在温经活血外治法的干预下,相比于KOA组则明显降低。此外,与KOA组相比温经活血外治法增加了大鼠DRG组织中UNC5的含量,虽无统计学意义,但仍呈上升趋势,我们还观察到KOA组中UNC5含量较空白组反而有所减少,这可能是因为KOA发生过程中激活了轴突导向因子Netrin-1并产生对神经元的吸引和排斥作用从而共同引发神经萌发的现象,导致疼痛的发生。对此,我们也观察到滑膜组织中疼痛因子CGRP的表达量在KOA组相比于空白组明显上升,而在温经活血外治法干预下则明显减少,这也符合我们的猜想。

前期研究中,我们报道了KOA滑膜组织中Netrin1与CGRP标记的神经纤维共定位,此外,与本研究相一致,Wang等也在KOA滑膜组织中观察到CGRP表达量的升高,预示着滑膜组织中CGRP相关神经密度的增加[28]。我们认为,对KOA疼痛相关研究而言,检测滑膜组织局部的CGRP可能更有说服力。同时,与我们的研究相似,新近的研究证实了Netrin-1参与外周痛敏,例如Zheng等的研究发现,Netrin-1诱导椎间盘性腰痛,介导椎间盘变性的神经支配和血管生成[29]。另有研究观察到KOA破骨细胞分泌Netrin-1,通过DCC受体对DRG神经元形成吸引导向,介导KOA小鼠的机械痛敏[30]。Ni的研究也表示,敲除破骨细胞中的Netrin-1可以有效消除多孔终板和脊柱超敏反应的感觉神经支配[31]。

综上所述,我们的研究表明温经活血外治法有助于缓解KOA滑膜炎症和抑制Netrin-1的表达,从而缓解疼痛,这可能是通过抑制轴突导向因子Netrin-1的分泌达到抑制神经萌发的作用,并干预了相关信号通路从而降低KOA疼痛,然而本研究的局限性同样需要关注:本研究的样本量较少,对大鼠的观察时间短、不连续,对此,在之后的研究中我们将进一步扩大总的样本量,深入研究“Netrin-1-神经萌发-疼痛”中的具体作用机制,为KOA的治疗提供全新的角度。