微RNA-223-3p调控NOD样受体热蛋白结构域3/胱天氨酸蛋白酶-1/白细胞介素-1β信号通路抗小鼠肝纤维化的作用及机制

胡毅翔，左清平，刘任祝，闫庆梓，邢琪昌，刘湘

作者单位：1湘潭市中心医院临床药学科，湖南 湘潭 411000；

2长沙市第一医院药剂科，湖南 长沙 410006

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是指肝脏遭到各种致病原侵袭，引起肝脏损害与炎症反应后，导致过度的细胞外基质释放，进而诱导肝星状细胞活化以及肝脏组织纤维化的病理过程［1-2］。目前临床尚缺乏治疗肝纤维化的有效手段，导致部分病人进展为肝硬化，严重影响病人的生活质量［3］。MicroR⁃NAs （miRNAs）是一类高度保守且化学性质稳定的内源性非编码RNA，多项研究表明miRNA与多种类型的肝脏疾病的发病机制相关［4］。微小RNA-223-3p（miR-223-3p）具有多种生物学功能，可抑制肝纤维化的发生及进展［5］。NOD 样受体热蛋白结构域3（NLRP3）炎性体是NOD 样受体（NLRs）家族成员之一，同时也细胞焦亡的关键起始位点，对于肝纤维化的进展起促进作用［6］。活化的NLRP3炎症小体可将胱天氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）剪切成熟，进而促进反向效应分子裂解细胞膜，释放成熟形式的白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-18，导致机体产生炎症，而IL-1β 作为早期的炎性细胞因子在炎症的发展过程中起重要作用［7］。本研究自2020 年10 月至2021 年6 月以质量浓度为40%四氯化碳（CCl4）腹腔注射诱导小鼠肝纤维化模型，以NLRP3/Caspase-1/IL-1β 信号通路为切入点，探究miR-223-3p对小鼠肝纤维化的影响与机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组本实验共计32只ICR小鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［许可证号SCXK（湘）2020-0006］，体质量范围为18~20 g，所有小鼠均在同一实验室按照清洁级小鼠要求由专人饲养，保持室内温度为20~24 ℃，相对湿度50%，小鼠自由进食摄水，将32 只ICR 小鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、miR-223-3p 模拟物（miR-223-3p agomir）组和阴性对照miRNA 模拟物（agomir-NC）组，每组8 只。本研究符合一般动物实验伦理学原则，经湘潭市中心医院伦理委员会批准（批号2020-KY-25）。

1.2 试剂和仪器四氯化碳购于国药集团化学试剂有限公司（批号20200106），血清总胆红素（TBIL）、白蛋白（Alb）、血清透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ⁃C）购自南京建成生物工程研究所，批号分别为101547、105647、106784、106541、105861；NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白抗体购自美国Santa Cruz 公司，批号分别为S5201RTA、S5410RES、S2144RYU；PCR 引物、miR-223-3p agomir 模拟物（批号20201201）及阴性对照agomir-NC 和阴性对照（批号20201202）购自广州瑞博生物科技有限公司。

全自动酶标仪（型号WD-2102B，北京六一仪器有限公司），病理图像分析仪（型号OLYMPUSDP71，奥林巴斯中国有限公司），荧光定量PCR 仪（型号：IQ5，美国Bio-Rad 公司）凝胶成像仪（型号：Gel Doc EZ，美国Bio-Rad 公司），DLAB 高速微量离心机（型号：D1524R，北京大龙仪器有限公司）。

1.3 肝纤维化小鼠模型制备和给药将ICR 小鼠随机分为空白组、模型组、miR-223-3p agomir 组和NC antagomir 组，每组8 只，共32 只。建立小鼠肝纤维化模型，建模步骤：采用质量浓度为40% CCl4花生油溶液腹腔注射，2 mL/kg，每周3 次，连续4 周。miR-223-3p agomir 组和agomir-NC 组于第4 周末尾静脉注射miR-223-3p agomir及agomir-NC（给药剂量均为200 nmol/L），每周给药3 次，连续给药2 周，空白组和模型组尾静脉注射等量的生理盐水。

1.4 血清指标检测第6周末，各组小鼠禁食12 h，采用摘眼球取血法取血1 mL，于25 ℃静置0.5 h 后于3 600 r/min 离心10 min，分离血清收集上清液，将上清液装置干净的EP 管中进行分装，置于−80 ℃冰箱中保存备用。按照生化试剂盒操作步骤测定小鼠血清总胆红素（TBIL）、白蛋白（Alb）、血清透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PC Ⅲ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）含量。

1.5 HE染色及Masson染色小鼠处死后，将肝脏周围的韧带组织游离，把肝脏小心取出，在肝乳头叶处用剪刀剪下一块2 cm3的肝组织，甲醛固定后制作石蜡切片。依据HE 染色及Masson 染色试剂盒说明书处理组织，脱水封片后于显微镜下随机选取5个视野拍照，观察各组小鼠肝组织病理变化。

1.6 纤维化半定量评分用半定量计分系统（SSS）检测肝脏的纤维化程度，用胶原纤维面积密度对肝纤维程度进行分析［7］。（1）炎症活动度半定量计分公式为汇管区炎症（0~3 分）+小叶内炎症（0~3 分）+碎屑坏死（0~2分）+桥接坏死（0~2分）；（2）纤维化半定量计分公式为小叶内炎症（0~3分）+汇管区炎症（0~3分）+纤维间隔数量×纤维间隔宽度（0~4分）；（3）胶原纤维面积密度：用图像成像分析软件对每张切片的5个视野中的纤维面积密度进行测定。

1.7 miR-223-3p靶基因预测、GO-KEGG分析采用Targetscan 数据库（https：//www.mirbase.org）对miR-223-3p 的靶基因进行预测及分析，通过Bioinfo数据库（http：//bioinfo. jialab-ucr. org/CancerMIR⁃Nome/），将miR-223-3p 的治疗靶点导入，进行 GO、KEGG 富集分析及功能分析，获取miR-223-3p 相关生物进程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）及KEGG富集分析数据，评价其生物学功能。

1.8 实时荧光定量PCR 检测分别取各组左叶的相同部位组织，超声粉碎，将组织用胰蛋白酶消化后加入总RNA 抽提试剂（Trizol）裂解提取总RNA，测定浓度及纯度，反转录成cDNA，引物序列如表1所示。cDNA 合成过程中采用特异性引物构建反转录体系，反应条件为：90 ℃预变性10 min，38 ℃40 min，90 ℃ 5 s。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP⁃DH）为内参，采用2−ΔΔCt法对NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表达进行相对定量分析。

表1 引物序列表

1.9 蛋白质印迹法检测肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表达分别取4 组小鼠50 mg 肝组织，蛋白裂解液裂解，用玻璃均浆器在冰上对组织进行研磨，30 min 后以12 000 r/min 的速度离心5 min，测定蛋白浓度，每个加样孔加入60 µg 的蛋白进行分析。电泳2 h 后，采用湿法转膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），将膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃孵育一抗（Santa Cruz；1∶1 000 稀释）过夜，次晨采用TBST漂洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（Santa Cruz；1∶3 000 稀释），37 ℃孵育1 h，凝胶成像系统曝光成像，以GAPDH 为内参，采用Quantity One 软件测光密度值。

1.10 统计学方法采用SPSS 25.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料符合正态分布，以表示，多组定量数据采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验分析，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝纤维化相关血清标志物检测与空白组相比，肝纤维化模型组小鼠血清TBIL、Alb、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 表达水平均显著升高（P<0.05），与模型组相比，miR-223-3p agomir 组小鼠血清TBIL、Alb、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），提示miR-223-3p agomir 可降低小鼠血清肝纤维化指标TBIL、Alb、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 的表达水平。见表2。

表2 AF对肝纤维化小鼠血清生化指标的影响/

表2 AF对肝纤维化小鼠血清生化指标的影响/

注：TBIL为血清总胆红素、Alb为白蛋白、HA为血清透明质酸、PCⅢ为Ⅲ型前胶原、Ⅳ-C为Ⅳ型胶原。①与空白组比较，P<0.001。②与模型组比较，P<0.001。

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2.2 各组小鼠肝组织HE 染色比较HE 染色结果如图1所示，相较于空白组，模型组小鼠肝小叶结构受损，组织切片中有大量假小叶形成，坏死病灶面积较大，大量的炎性细胞浸润到肝组织中，细胞排列较乱无规则。给予miR-223-3p agomir 干预后，小鼠肝小叶炎症浸润情况明显改善，肝组织内浸润的炎性细胞明显减少，坏死病灶也显著减少，大多数的肝细胞都整齐排列，肝小叶结构有所恢复，说明miR-223-3p agomir 能明显抑制肝纤维化的进展，减少炎症细胞浸润。

图1 小鼠肝组织（HE染色×100）：A为空白组；B为模型组；C为miR-223-3p agomir组；D为agomir-NC组

2.3 各组小鼠肝组织Masson染色比较Masson染色结果如图2所示，相较于空白组，模型组大量炎性细胞浸润导致小鼠肝小叶正常结构受损，大量胶原及细胞外基质沉积导致肝细胞纤维化，胶原纤维增生严重。给予miR-223-3p agomir 干预后，相较于模型组，小鼠肝脏组织纤维化状态显著改善，肝小叶胶原及细胞外基质明显减少，局灶性坏死组织显著减少，从而抑制肝纤维化的形成与进展。

图2 小鼠肝组织（Masson三色染色×100）：A为空白组；B为模型组；C为miR-223-3p agomir组；D为agomir-NC组

2.4 各组小鼠纤维化半定量评分比较纤维化半定量评分比较，模型组小鼠炎症活动度半定量评分、纤维化半定量评分和胶原纤维面积密度较sham组均显著升高（P<0.05）；干预后的miR-223-3p agomir 组小鼠炎症活动度半定量评分、纤维化半定量评分和胶原纤维面积密度均得到了明显的抑制，较HF组显著降低（P<0.05）。见表3。

表3 各组小鼠肝组织纤维化半定量评分比较/

表3 各组小鼠肝组织纤维化半定量评分比较/

注：①与空白组比较，P<0.001。②与模型组比较，P<0.001。

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2.5 miR-223-3p 靶基因结合位点及GO-KEGG 分析通过DAVID 数据库，获取miR-223-3p的治疗靶点及相关生物学过程分析结果。GO、KEGG 富集及miRNA-mRNA-KEGG 关联分析结果显示，miR-223-3p 可在炎症、T 细胞免疫、细胞周期等的59 个生命进程中发挥作用。KEGG 结果中治疗靶点共富集FOXO 信号通路、p53 信号通路、HIF-1 信号通路等12 条信号通路，根据P 值选出前30 位KEGG 的全部结果，对选定的GO、KEGG 结果中P值取−lgP，并作为横坐标，绘制GO、KEGG 条形图。Targetscan 数据库对miR-223-3p 靶基因预测结果显示NLRP3 可能为miR-223-3p 的反向靶基因（图3）。生物学靶点预测分析结果显示miR-223-3p 可靶向作用于NLRP3，结合位点如图4所示。

图3 富集分析图：A为GO生物学功能；B为KEGG通路

图4 miR-223-3p与靶基因NLRP3结合位点分析

2.6 实时荧光定量PCR 检测结果与空白组比较，模型组小鼠肝组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 表达水平明显上升（P<0.05），与模型组相比，给予miR-223-3p agomir 干预后，miR-223-3p agomir组小鼠肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 表达［（1.24±0.12）比（2.17±0.14）、（1.44±0.11）比（2.65±0.18）、（1.31±0.13）比（1.97±0.21）］均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），而给予agomir-NC后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表达与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表4。

表4 q-PCR法检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量

2.7 蛋白质印迹法检测结果蛋白质印迹法检测结果如图5、表5所示，与模型组比较，给予miR-223-3p agomir干预后，小鼠肝组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表达［（0.89±0.05）比（1.93±0.04）、（1.29±0.07）比（2.15±0.09）、（1.50±0.05）比（2.52±0.12）］均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），而给予agomir-NC 后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 表达与模型组差异无统计学意义（P>0.05），表明miR-223-3p agomir 可抑制小鼠肝组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表达。

图5 蛋白质印迹法检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达情况

表5 q-PCR法检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量

3 讨论

炎症被认为是宿主对抗病原体的一种防御机制，在相关刺激下可产生炎症因子激活固有免疫。炎症小体是细胞内的一种大型多蛋白复合物，在识别病原体或危险信号后可介导炎症反应的起始，导致细胞膜裂解，释放多种炎性细胞因子诱导细胞焦亡的发生及进展［8-9］。NLRP3 炎症小体主要由NOD样受体NLRP3，衔接分子凋亡相关斑点样蛋白CARD（ASC）以及效应分子pro-caspase-1 组成［10］。在细胞内外刺激下，NLRP3 炎症小体被激活并剪切pro-caspase-1，诱导效应分子在细胞膜上形成直径为10~15 nm 的膜孔，进而导致IL-1β和IL-18释放到细胞外从而促进细胞焦亡的发生［11］。

肝纤维化早期阶段以多种炎性细胞因子和免疫细胞因子浸润为特征［12］。这一病理过程主要包括3个阶段：①愈合阶段，②炎症阶段，③重塑阶段。这一炎症过程主要由上皮细胞和内皮细胞介导，并触发炎症细胞（包括巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）的募集。NLRP3炎症小体表达于内皮细胞、免疫细胞、肝脏细胞等细胞中，NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路激活后可导致炎症细胞募集，通过分泌大量的炎症细胞因子加速肝细胞的炎症性死亡，进而导致肝纤维化的进展［13］。由于NLRP3 炎症小体在细胞焦亡中的重要调控作用，抑制其活化可能为肝纤维化提供潜在的治疗策略。MCC950是一种阻断NLRP3炎症小体活化的特异性小分子抑制剂。机制上，MCC950 直接与NLRP3 的NACHT 结构域结合，抑制腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水解，阻止NLRP3 炎症小体形成，阻断经典和非经典的性NLRP3活化通路［14-15］。研究显示，miRNA 具有多种生物学功效，以NLRP3 炎性小体为靶点的miRNA 治疗策略是目前肝纤维化治疗研究的重点方向［16-17］。

miR-223-3p 由于其广泛的生物学作用已成为目前研究者重点关注的miRNAs 分子。研究表明，miR-223-3p 作为抑癌因子在肝细胞癌细胞中异常低表达，并调控细胞增殖，同时可发挥抗炎作用［18］。Ji等［19］的研究发现，人环状RNA-0070963（Hsa_circ_0070963）可通过调控miR-223-3p 的表达抑制肝星状细胞活化及IL-1β、IL-1β等炎症细胞因子的表达，进而抑制肝纤维化的发生及进展。另有研究表明，miR-223-3p 可抑制肝细胞炎症性损伤，抑制细胞外基质的沉积［20］。与普通miRNA 模拟物（mimics）相比，miRNA 体内模拟物（agomir）与细胞膜亲和力更高，特别适合动物体内干扰实验，并且在体内实验中具有更高的稳定性和抑制效果，可以采用全身注射或局部注射等多种方式给药［21］。本项目通过建立小鼠肝纤维化模型，采用静脉注射的方式给予生物模拟物miR-223-3p agomir，探讨miR-223-3p agomir对肝纤维化小鼠的治疗作用。

本实验结果显示，miR-223-3p agomir 可显著抑制四氯化碳诱导的小鼠肝损伤，降低TBIL、Alb、HA、PC Ⅲ、Ⅳ-C 的表达水平，此外，miR-223-3p agomir 可有效抑制肝纤维化小鼠的炎症状态。HE染色和masson 染色结果显示，模型组大量炎性细胞浸润导致小鼠肝小叶正常结构受损，大量胶原及细胞外基质沉积导致肝细胞纤维化，胶原纤维增生严重，细胞排列较乱无规则，给予miR-223-3p agomir干预后，肝脏组织纤维化状态显著改善，肝小叶胶原及细胞外基质明显减少，局灶性坏死组织显著减少，表明miR-223-3p agomir 可显著改善肝纤维化组织炎症细胞浸润，降低肝纤维化组织评分，抑制肝纤维化的进展。此外，miR-223-3p agomir 尾静脉注射可降低小鼠肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表达水平，表明 miR-223-3p agomir 可抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡通路的激活。综上所述，过表达miR-223-3p 可抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的激活，降低机体炎症损伤，改善小鼠肝组织损伤，进而发挥抗肝纤维化作用。

（本文图1~3见插图8-6）