一测多评法测定止血化痔合剂中6种黄酮类成分的含量

2023-07-16陈根光杨丽娜周承芳王庆芬

安徽医药 2023年8期

陈根光，杨丽娜，周承芳，王庆芬

作者单位：联勤保障部队第九〇九医院、厦门大学附属东南医院药剂科，福建漳州 363000

止血化痔合剂由黄芩、地榆炭、炙黄芪、郁李仁、槐花炭、升麻、甘草、黄柏、赤芍等9 味中药配制而成，具有清热燥湿、益气养血、凉血止血和消肿的功效［1］，对痔疮的治疗有积极的作用，其中黄酮类成分为其主要活性成分［2］。近年来，对中药处方中主要成分进行定量分析被认为是对中药进行质量控制的有效方法，但该方法必须提供待测目标物的高纯度标准品，而一测多评法（QAMS）只须提供一种标准品就可以同时检测多种成分的含量，能有效减少分析时间，节省对照品用量，降低检测成本。由于止血化痔合剂成分复杂、活性成分种类较多，因此，仅靠对单一成分的定量测定无法完全反映中药复方制剂多成分、多靶点、协同起效等特点，难以实现对该制剂的质量控制，故本实验自2022 年2―5月采用一测多评法，以黄芩苷为内参物，通过对止血化痔合剂中黄酮类成分进行含量测定，为止血化痔合剂的质量评价提供更全面、多指标的质量控制依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪［二极管阵列检测器（DAD），美国Agilent 公司］； AUW120D 型电子分析天平（精度：0.01 mg，岛津企业管理（中国）有限公司）；水为纯化水，磷酸、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

对照品芦丁（批号GZDD-0001，纯度≥98%），甘草苷（批号GZDD-0388，纯度≥98%），黄芩苷（批号GZDD-0037，纯度≥98%），槲皮素（批号GZDD-0002，纯度≥98%），黄芩素（批号GZDD-0118，纯度≥98%），汉黄芩素（批号GZDD-0714，纯度≥98%），均购自贵州迪大生物科技有限责任公司。止血化痔合剂由本院药剂科制剂室自制。

2 方法与结果

2.1 一测多评方法学考察

2.1.1 色谱条件色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液，梯度洗脱：0～10 min，0%～19%乙腈；10～20 min，19%～23% 乙腈；20～25 min，23%～30% 乙腈；25～30 min，30%～48%乙腈；30～40 min，48%～80%乙腈；流速：1.0 mL/min；检测波长：275 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 µL。在上述色谱条件下，各成分色谱峰分离度均大于1.5，理论板数均大于5 000。混合对照品、样品色谱图见图1。

2.1.2 混合对照品溶液的制备分别取芦丁、甘草苷、黄芩苷、槲皮素、黄芩素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为320.3、64.80、155.7、65.55、180.9、5.00 mg/L的混合对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液的制备精密量取相应批号的止血化痔合剂2 mL，置25 mL 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.4 线性关系考察分别精密吸取混合对照品溶液3、6、8、10、12、15 µL，注入高效液相色谱仪。以对照品进样质量为横坐标（X），以对照品的峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得各成分的线性回归方程，见表1。

表1 混合对照品溶液中6种成分线性关系考察结果

2.1.5 精密度试验取混合对照品溶液，连续进样6 针，计算峰面积。含芦丁、甘草苷、黄芩苷、槲皮素、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD 分别为1.0%、1.0%、0.8%、1.2%、2.0%、0.9%。

2.1.6 稳定性试验取止血化痔合剂（批号20211215），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24 h 进行测定，计算峰面积。含芦丁、甘草苷、黄芩苷、槲皮素、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD 分别为2.9%、1.0%、0.4%、1.5%、3.0%、1.5%。

2.1.7 重复性试验取止血化痔合剂（批号20211215），按“2.1.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别进样分析，记录6 种成分的色谱峰面积。含芦丁、甘草苷、黄芩苷、槲皮素、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD 分别为3.1%、2.7%、0.5%、2.2%、2.9%、1.0%。

2.1.8 加样回收率试验精密量取6份已知含量的止血化痔合剂（批号20211215），每份1 mL，置25 mL量瓶中，再分别精密量取并加入对照品溶液适量，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10µL，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，含芦丁、甘草苷、黄芩苷、槲皮素、黄芩素、汉黄芩素的平均加样回收率分别为99.07%、96.86%、100.43%、95.72%、96.38%、98.93%，RSD 分别为2.7%、2.8%、2.0%、2.5%、3.2%、2.4%。

2.2 相对校正因子（f）的确定依次精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液3、6、8、10、12、15 µL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以黄芩苷（s）为内参物，按下列公式分别计算含芦丁（a）、甘草苷（b）、槲皮素（c）、黄芩素（d）、汉黄芩素（e）的f值。

式中As为内参物对照品s峰面积，Cs为内参物对照品s浓度，Ai为某待测成分对照品i峰面积，Ci为某待测成分对照品i浓度，结果见表2。

表2 相对校正因子（f）计算结果

2.3 相对校正因子的耐用性和系统适用性评价

2.3.1 流速对相对校正因子的影响采用Agilent 1200 高效液相色谱系统和Agilent C18柱，分别考察流速为1.10、1.05、1.00、0.95、0.90、0.80 mL/min 时黄芩苷对其他成分的相对校正因子，结果各成分相对校正因子在不同的流速下重复性良好，结果见表3。

表3 不同流速对相对校正因子（f）的影响

2.3.2 柱温对相对校正因子的影响采用Agilent 1200 高效液相色谱系统和Agilent C18柱，分别考察柱温为18、20、25、30、35、40 ℃时黄芩苷对其他成分的相对校正因子，结果各成分相对校正因子在不同的柱温下重复性良好，结果见表4。

表4 不同柱温对相对校正因子（f）的影响

2.3.3 不同色谱柱对相对校正因子的影响分别考察依利特Kromasil C18（4.6 mm×250 mm， 5 µm）和Agilent ZORBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 µm）色谱柱测定时，黄芩苷对其他成分的相对校正因子，结果见表5。

表5 不同色谱柱对相对校正因子（f）的影响

2.4 待测组分色谱峰的定位分别考察保留时间（t）、相对保留时间（r）和相对保留时间差（Δt）在两种不同色谱柱条件下的稳定性。实验研究发现采用保留时间时，芦丁、甘草苷、黄芩苷、槲皮素、黄芩素、汉黄芩素的RSD 值依次为4.0%、5.5%、4.0%、2.2%、1.4%、0.8%；采用相对保留时间时，以黄芩苷为内参物，芦丁、甘草苷、槲皮素、黄芩素、汉黄芩素的RSD 值依次为0.1%、1.5%、1.7%、2.5%、3.2%；采用相对保留时间差时，以黄芩苷为内参物，芦丁、甘草苷、槲皮素、黄芩素、汉黄芩素的RSD 值依次为3.9%、2.5%、4.3%、2.3%、2.9%。结果表明采用相对保留时间法RSD 均小于或接近于3.0%，对色谱峰定位较为稳定，因此对待测组分进行定位时宜选择相对保留时间法。

根据以上考察结果，最终确定芦丁、甘草苷、槲皮素、黄芩素、汉黄芩素的相对校正因子分别为6.426、3.939、3.215、41.140、0.555。

2.5 样品测定取11 批样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，分别采用一测多评法和外标法（ESM）计算样品中6 种黄酮类成分的含量，结果见表6。经成组t检验，表明通过两种方法的测定结果差异无统计学意义（P>0.05）。

表6 样品测定结果/（mg/g）

3 讨论

3.1 一测多评法的优势分析QAMS 技术由王智民等［2］于2006 年提出，通过将性质稳定，价廉易得的化学组分作为内参物，利用各组分之间的函数关系，实现对多个成分含量的同时测定，能从整体上对中药、饮片及复方制剂的质量进行控制，具有经济、高效、简单的优势［3-8］。随着分析仪器的迭代升级，目前通过QAMS技术与HPLC、HPLC-MS、UPLC、GC- MS等仪器联用，使得该技术被广泛应用在中药材及其制剂质量的评价，炮制工艺和炮制产品质量的评价、原料中农药残留的测定和多成分定量分析等多个方面［9-10］。

3.2 制剂质控指标的确定止血化痔合剂中的黄酮类成分，包括有芦丁、槲皮素、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、毛蕊异黄酮苷、山柰酚、异鼠李素和甘草苷等数十种，在益气养血、清热燥湿、凉血止血消肿等功效中发挥着重要作用。本实验所选6种黄酮类成分在供试品溶液中含量较高，且药理活性与止血化痔合剂的功能主治密切相关，其中芦丁和槲皮素是槐花炭的主要活性成分，可凉血止血、清肝泻火［11］。黄芩可清热燥湿、泻火解毒、止血，具有解热抗炎、调节免疫等作用［12］，黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素为其主要黄酮类成分。黄芪中含有槲皮素，与升麻合用，补气以养血［13］。甘草味甘，性平，可补脾益气、缓急止痛、清热解毒、调和诸药［14］，甘草苷为其指标性成分。因此，将这6 种黄酮类成分作为质量控制指标，建立止血化痔合剂多指标定量测定方法，可提高该复方制剂质量控制的整体性和特征性。

3.3 色谱条件的考察和内参物的选择本实验采用DAD 检测器在波长190～400 nm 范围内扫描混合对照品和供试品溶液，发现6 种黄酮类成分在275 nm 具有较大吸收，且干扰小，故实验以275 nm为检测波长。黄芩苷是黄芩的指标性成分，含量较高，其对照品化学性质稳定且廉价易得，便于长期大量分析实验中使用，因此实验选择黄芩苷为内参物进行其他指标性成分的一测多评法定量测定。

3.4 相对校正因子差异情况讨论本文以黄芩苷为内参物，计算供试品中黄芩素和汉黄芩素的相对校正因子，分别为41.140、0.555，两组数据与已报道文献存在差异，见表7。由于本制剂由9 味中药材共煎所得，组成较为复杂，考虑由于煎煮过程中成分间相互作用，造成合剂中黄芩素和汉黄芩素的含量差异。此外通过对比过往文献，黄芩提取物中黄芩素和汉黄芩素的含量，根据其处方组成和制剂类型的不同，计算所得的相对校正因子也存在差异。后续计划对黄芩单味药材在相同工艺下进行提取，考察所得药液中黄芩素和汉黄芩素的含量。