基于网络药理学探讨二白膏治疗慢性湿疹的作用机制

王羽侬，冯蕙裳，王莹，王家悦，李元文，张丰川

作者单位：1北京中医药大学东方医院皮肤科，北京 100029；

2北京中医药大学第三附属医院皮肤科，北京 100029；

3北京中医药大学东直门医院皮肤科，北京 100027

慢性湿疹常由急性及亚急性湿疹迁延不愈而成，常表现为患部皮肤肥厚粗糙，呈苔藓样变、鳞屑及皲裂，瘙痒程度轻重不一，病情迁延反复数月或数年。多发于手足、躯干四肢间擦部位及外阴、肛门等处，以四肢多见，常对称分布。慢性湿疹病人无法忍受症状反复发作，严重影响其正常生活和工作，无论生理还是心理都遭受长期折磨［1］。目前外用药治疗中，糖皮质激素药膏应用最为广泛，但存在长期应用耐药、激素依赖等问题；中医外治常采用多种中药外洗及中成药软膏涂抹［2］。慢性湿疹属于中医“湿疮，血虚风燥证”范畴，治疗以活血祛风，润燥止痒为原则。

二白膏为导师张丰川教授经验方，由白及粉、三七粉组成，用时取适量加凡士林调和成膏涂抹患处，具有润燥生肌、养血活血、收敛止痒的功效。张教授多年在临床中用其治疗身体各部位慢性湿疹，改善皮肤粗糙肥厚、皲裂及瘙痒疗效甚佳，且使用方便易携带，病人依从性好。本研究在2019年的临床研究基础上，于2022 年1―5 月开展网络药理学研究，从药物活性成分出发，多角度、多层次联系“药物-疾病-基因”相互作用靶点及相关作用通路，探讨二白膏多靶点整合调节慢性湿疹的作用机制，进而验证其临床疗效。

1 材料与方法

1.1 复方二白膏活性成分的筛选及靶点预测利用中药系统药理学平台（TCMSP）搜集白及、三七化学成分，将类药性≥0.18 和脂水分配系数<0.5 作为机体对外源化学物的吸收、分布、代谢和排泄（ab⁃sorption，distribution，metabolism，and excretion，AD⁃ME）性质参数以预测以上单味药的有效成分。为避免个别认可度较高的有效成分被筛选掉，故同时查阅《中国药典（2015 版）》与CNKI 中相关文献，得到此类成分并合并至TCMSP 数据库筛选结果。通过SwissTargerPrediction 网站（http：//www. swisstarget⁃prediction.ch/）进行靶点预测［3］。

1.2 慢性湿疹靶点预测在人类在线孟德尔遗传平台（OMIM，https：//www.omim.org/）和人类基因数据库（GeneCards，http：//www.genecards.org/）输入关键词“chronic eczema”获取慢性湿疹的靶点。

1.3 成分疾病共有靶点的获取及蛋白-蛋白互作网络的构建将二白膏靶点与慢性湿疹靶点通过Draw Venn Diagrams 网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，得到成分疾病共有靶点。将共有靶点导入String网站（https：//string-db.org/）绘制蛋白-蛋白互作网络图（protein-protein in⁃teraction，PPI），并利用Cytoscape 3.9.1软件对蛋白网络结构进行可视化处理及拓扑特征分析，以“节点度中心性”（degree centrality，DC）、“中介中心性”（betweenness centrality，BC）及“接近中心性”（close⁃ness centrality，CC）3 个参数的中位数作为筛选条件，筛选2次得到成分治疗疾病的核心靶点。

1.4 GO 分析和KEGG 富集分析基因本体论GO分析是一种可以通过生物途径对基因进行说明与注释的富集分析方法。京都基因与基因组百科全书通路分析可对筛选靶标参与的通路进行富集分析。本研究将成分对疾病的直接作用靶点导入DA⁃VID 网站（https：//david.ncifcrf.gov/），进行GO 和KEGG分析。

1.5 网络构建将二白膏药物、有效成分、靶点及作用通路导入Cytoscape 3.9.1 软件，建立“药物-成分-靶点-通路”网络。

1.6 分子对接分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法。主要研究分子间（如配体和受体）相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。本研究基于在线CB-Dock 网站（http：//cao.labshare.cn/）进行分子对接验证［4］；通过蛋白质晶体结构数据库PDB（https：//www.rcsb.org/）得到核心靶点的3D 晶体结构，TCMSP 网站得到成分的mol2 结构，同时将活性成分的mol2结构和靶点的PDB 文件导入CB-Dock网站，进行分子对接。

2 结果

2.1 二白膏化学成分筛选与靶点预测从TCMSP数据库搜索二白膏各味药的化学成分，白及36 种，三七119 种；根据其中“类药性≥0.18 和脂水分配系数<0.5”条件，选定17 种成分作为活性成分，其中白及9 种，三七8 种，另从药典及相关文献［5-6］验证指标性成分。

将活性成分通过SwissTargetPrediction 数据库进行的靶点预测，去除重复项后共得到626 个成分靶点。

2.2 慢性湿疹靶点以“chronic eczema”为关键词在OMIM 和GeneGards 数据库中分别找到2 342 和2 421个疾病靶点，筛选、合并去除重复项后，共得到689种疾病靶点。

2.3 药物成分与疾病靶点映射结果及PPI 网络的构建通过Draw Venn Diagrams 网站，得到97 个共有靶点，如图1所示。

图1 二白膏靶点和慢性湿疹靶点的韦恩图

String 网站是一个功能蛋白关联网络，可以预测蛋白质与蛋白质之间的相互作用。将所有靶点导入网站后，得到PPI 网络图，其中一个靶点被String网站自动删除，保存为TSV格式后，并利用Cy⁃toscape 3.9.1 软件对蛋白网络结构进行拓扑特征分析，筛选成分治疗疾病的核心靶点，如图2，表1 所示；将构建的PPI网络进行可视化处理，如图3所示。将15 个核心靶点排序后，SRC（度值=60）、ESR1（度值=42）、MMP9（度值=44）、AKT1（度值=67）、EGFR（度值=58）是该网络中的关键靶点。

图2 PPI网络的拓扑筛选过程

图3 二白膏中97个靶点的PPI网络图

表1 二白膏治疗慢性湿疹的15个核心靶点信息

2.4 GO 分析及KEGG 富集分析利用DAVID 网站对97 个靶点进行富集分析。以FDR<0.05 为筛选条件，得到GO 生物学条目146 条，主要涉及细胞信号传导（细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡等）、炎症反应、免疫反应等方面，根据FDR 值排序后，排名前10的生物过程如图4所示。由此推测二白膏治疗慢性湿疹可能是一个复杂的多途径协同作用的结果。

图4 97个靶点的GO富集分析

为了进一步揭示二白膏治疗慢性湿疹的作用机制，我们对97 个靶点进行KEGG 通路分析，根据FDR<0.05 及慢性湿疹相关信号通路筛选出18 条相关途径，分析结果如图5所示，可以发现这些基因数目主要在PI3K-Akt 信号通（hsa04151）（见图6）、JAK-STAT 信号通路（hsa04630）、TNF 信号通路（hsa04668）、MAPK信号通路（04010）等相关通路。

图5 97个靶点的KEGG通路分析

图6 KEGG通路图（PI3K）

2.5 “药物-成分-靶点-通路”网络的构建为了更好地阐明药物、成分、靶点和通路之间的关系，我们使用Cytoscape 3.9.1 构建了“药物-成分-靶点”网络（图7A）及靶点-通路网络（图7B）。通过该网络，我们可以直观地展示二白膏治疗慢性湿疹的有效物质及其可能的作用机制。

图7 药物-成分-靶点-通路网络图：A为药物-成分-靶点网络图(绿色节点代表药物，黄色节点代表成分，蓝色节点代表靶点)；B为靶点-通路网络图(红色节点代表核心靶点，黄色节点代表核心靶点外的靶点，蓝色节点代表通路)

2.6 分子对接验证根据PPI 网络及拓扑学分析，选择“度”排名前5 的靶点SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）、ESR1（雌激素受体α）、MMP-9（基质金属蛋白酶-9）、AKT1（丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶1）、EGFR（表皮生长因子受体）；通过构建核心靶点-成分网络（图8），选择对应核心靶点数最多的前4个化合物ginsenoside f2（人参皂苷F2）、3-（p-hydroxyben⁃zyl）-4-methoxy-9，10-dihydrophenanthrene［3-（对-羟苄基）-4-甲氧基-9，10-二氢菲］、DFV（二羟基黄烷酮）、Diop（邻苯二甲酸二异辛酯）做进一步分析。基于在线对接网站，将5 个靶蛋白与4 个活性成分分别进行对接，结果见表2。表2中受体和配体进行分子对接所得到复合物的得分越低，代表受体和配体亲和力越高。20 种对接方法均显示较好的对接活性，表明二白膏的活性成分可能通过与SRC、ESR1、MMP9、AKT1、EGFR 等活性靶点作用，发挥治疗慢性湿疹的作用。

图8 核心靶点-成分网络：图左节点代表核心靶点，图右节点代表成分

表2 二白膏治疗慢性湿疹的成分与靶点的结合能/（kJ/mol)

3 讨论

湿疹属中医“湿疮”范畴，常反复发作，瘙痒剧烈［7］。中医认为湿邪郁久耗伤气阴，局部血虚津亏，肌肤失养，故皮肤干燥粗糙、肥厚乃至皲裂。西医认为本病与免疫、遗传、过敏原、皮肤屏障功能障碍等因素有关，局部治疗多采用糖皮质激素［8-9］。但局部外用药物治疗存在潜在的不良反应，如诱发感染、皮肤烧灼感、皮肤萎缩、毛细血管扩张等，且易形成激素依赖，停药后症状反复［10］。

二白膏为张丰川教授治疗慢性湿疹局部外用药多年经验方，临床应用疗效确切。白及、三七均为植物药，无毒性，无特殊气味，颜色较浅，对皮肤美观无碍，且几乎无不良反应，方便病人自行调配及随身携带，病人依从性好。《唐本草》载白及“手足皲拆，嚼以涂之”，言其因味涩收敛，能生肌敛疮，治疗手足皲裂、肛裂等收效甚佳。现代研究表明其可缩短凝血时间及抑制纤溶，具有良好的局部止血作用，能形成人工血栓而止血［11］。其根中含白及甘露聚糖，具抗溃疡活性［12］。体外实验表明白及对多种细菌及真菌有一定抑制作用［13］。还可以通过提高细胞外角质胶原水平、伤口巨噬细胞数量以抵御氧化、帮助皮肤生成皮肤保护膜［14］，可谓是卓越的药用辅料，可见治疗慢性湿疹大有裨益。三七“能治一切血病”，具有养血止血、补血散瘀、活血定痛的功效。现代药理学研究认为三七中主要含有皂苷类、三七素、三七氨酸等成分［15］，具有活血、止血、促造血；抗氧化、促进成纤维细胞和胶原合成、改善皮肤组织结构；抗组胺、增强皮肤免疫力、抗炎等作用［16-17］。可见二白膏对过敏性炎症性皮肤病有较好的抗过敏抗炎作用，减轻慢性湿疹。

本研究进行了二白膏中有效成分与靶点相互作用网络拓扑筛选、PPI 网络的构建与分析、GO 富集分析和 KEGG 通路分析等。从药物-成分-靶点网络图可以看出，二白膏的关键化合物主要集中在人参皂苷F2、二氢菲类化合物、食脂素、邻苯二甲酸二异辛酯，其中人参皂苷F2 表现了高强度的活性，主要存在于三七中。多项研究表明，人参皂苷F2作为具有抗氧化应激作用的天然产物，可通过一系列信号通路发挥抑制细胞凋亡作用［18］，且被证实具有良好的抗菌、抗炎活性［19］，可通过增加IL-10和Tregs的表达，降低IL-17和Th17细胞的表达来减轻炎症［20］。二氢菲类化合物可有效地抑制炎性因子的产生，有抗病原菌［21］、解痉、抗血小板凝集、抗过敏等生物活性［22］。三七中的食脂素、邻苯二甲酸二异辛酯在抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力等方面发挥了重要的药理活性［23-24］。从基因蛋白分子层面，二白膏的分子作用靶点中有15个与慢性湿疹关的核心靶点，这15 个靶点进行 PPI 网络分析，可以发现主要分为细胞因子和蛋白激酶。细胞因子中AKT1、SRC、EG⁃FR、VEGFA、STAT3等体现了高度的协同作用，也是二白膏治疗慢性湿疹发挥药理作用的主要作用靶点。AKT1 是核降解的重要因子，参与了湿疹模型中角化不全病理中的角质细胞终末分化和角质化包膜形成的关键过程［25］。SRC 是重要的抗炎因子，有体外实验证实某种中药成分在NF-κB 信号通路中通过作用于SRC 而发挥抗炎作用［26］。外国学者Su 等［27］研究发现基因多态性和基因间相互作用，证明EGFR、SRC 和STAT3 作为转录因子或复合物发挥作用，介导基因转录和激活，并与肿瘤生长、肿瘤血管生成、胚胎植入和抗磷脂综合征相关，能通过调节多种炎症相关细胞因子参与免疫反应。故笔者从分子层面猜测，二白膏通过抗炎、修复皮肤组织，调控皮肤角化来治疗慢性湿疹。从功能作用层面，GO 富集分析得到的条目中，主要涉及增强细胞增殖及迁移、抑制细胞凋亡、增加蛋白激酶活性、细胞表面黏附复合物、炎症反应、信号传导等多种生物过程，可作为二白膏治疗慢性湿疹的关键过程。KEGG 通路富集分析筛选得到18 条信号通路，基因数目在P13-Akt 及JAK-STAT 通路上富集较多。其中PI3K-Akt 信号通路可被多种类型的细胞刺激或毒性损伤激活，调节细胞的基本功能，如转录、翻译、增殖、生长和存活。已有大量证据表明，AKT 一旦被激活，可以通过磷酸化参与细胞凋亡、蛋白质合成、代谢和细胞周期的底物来控制关键的细胞过程［28］。且AKT1 缺失的小鼠可显著抑制微血管通透性和白细胞向炎症部位的募集，使得过敏反应明显减轻［29］，与本文中最主要的核心靶点作用机制相佐证。根据我们的研究结果，通过抑制AKT1 从而降低 PI3K -Akt 信号通路可能在二白膏活性成分治疗慢性湿疹中发挥至关重要的作用。此外，抑制JAKSTAT 信号通路可降低炎症，改善细胞稳态［30］，且有研究证实糖皮质激素正是通过抑制本文核心靶点中的IL-2 所诱导的JAK-STAT 通路来发挥其强效抗炎作用［31］。可见二白膏的药理作用与糖皮质激素有异曲同工之妙，且使用安全，不具有其可能产生的不良反应。

综上所述，本研究通过网络药理学对二白膏治疗慢性湿疹的作用机制进行了探究，证明为多成分、多靶点、多途径的复杂网络协同作用的结果，可以推测二白膏通过抗炎、抗氧化、调控细胞增殖和凋亡、修复皮肤屏障等作用来治疗慢性湿疹，临床应用前景广阔。

（本文图1~6见插图8-2，图7，8见插图8-3）