有髯鸢尾系间远缘杂交障碍研究

王诗婷 石安琪 范诸平 高亦珂 王鑫姿 李丛丛 张启翔

(北京林业大学 园林学院,北京 100083)

有髯鸢尾(Bearded iris) 观赏价值高,在园林和庭院绿化中应用广泛。有髯鸢尾原产地欧洲中部和南部夏季少雨,而中国大部分地区属于亚热带或温带季风气候,夏季高温多雨,栽培有髯鸢尾夏季易染病致死,严重影响其推广及应用[1]。因此,解决有髯鸢尾夏季根腐问题是扩大其应用范围的关键。

鸢尾属内不同系间远缘杂交可为有髯鸢尾引入其他鸢尾中适应夏季高温高湿的特性,为提高其对高温高湿的耐受性提供更大的潜力。但有髯鸢尾系间远缘杂交存在严重障碍,人工杂交难以得到后代。将有髯鸢尾作父本与鸢尾(Iristectorumf.albaMakino)、黄菖蒲(IrispseudacorusL.)和西伯利亚鸢尾(IrissibiricaL.)杂交均未成功[2]。过去100余年的时间里,以有髯鸢尾作母本与鸢尾系间远缘杂交共获得Loptec[3]、Ariel-tec[4]、Flying Dragon[5]、Dragonscrest[6]和Paltec[7]这5个品种,但杂交过程不祥且品种真实性未得到验证;同时这5个品种花部特征具有父本特点,垂瓣中央的髯毛表现为毛和鸢尾鸡冠状附属物的结合。系间杂种的存在说明有髯鸢尾系间杂交存在可行性。此外,有研究利用原生质体融合技术获得燕子花鸢尾类玉蝉花(Irisensata)和有髯鸢尾品种G1组培苗[8]。以往很难通过人工杂交获得有髯鸢尾系间远缘后代,因此,探索有髯鸢尾系间远缘杂交障碍发生时期及克服方法是获得有髯鸢尾系间远缘杂交后代的关键。

本研究将有髯鸢尾与无根腐病的鸢尾和无髯类的西伯利亚鸢尾人工授粉,进行系间远缘杂交,通过对花粉原位萌发和子房发育观测,判断不同组合远缘杂交主要障碍,确定胚拯救时期;并利用胚拯救技术克服受精后障碍获得鸢尾系间杂交幼苗,旨在为提高有髯鸢尾远缘杂交效率,培育抗根腐病能力提高的有髯鸢尾新品系提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

杂交试验材料栽培于国家花卉工程技术研究中心苗圃(40°09′ N,116°26′ E)。亲本:‘白与黄’‘印度首领’‘音箱’及其杂交后代等有髯鸢尾、鸢尾和西伯利亚鸢尾。

1.2 试验方法

1.2.1亲本和杂交组合

设置4个杂交组合:有髯鸢尾与鸢尾正反交、有髯鸢尾与西伯利亚鸢尾正反交,去雄人工授粉杂交。

1.2.2花粉原位萌发观测

授粉后2、4、6、12、24、48 h,每组合取3个已授粉雌蕊,使用卡诺固定液固定,置于70%酒精贮存。用0.1%水溶性苯胺蓝染色,在荧光显微镜下观测拍照。

1.2.3子房发育动态观测

每组合随机选取5个子房,授粉后每3 d观测子房中部直径,取平均值。

1.2.4子房坐果率统计

观察4个系间远缘杂交组合子房发育情况,授粉后5～7 d统计坐果率。

坐果率=(果实数/授粉花朵数)×100%

1.2.5胚拯救

授粉后持续观察子房发育动态,当子房停止发育,将胚珠从子房中取出,接种至含MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和MS+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的培养基中[9]。

2 结果与分析

2.1 花粉在柱头上萌发的荧光观察与杂交障碍分析

2.1.1有髯鸢尾与鸢尾正反交组合花粉萌发与花粉管生长状况分析

以有髯鸢尾为母本,与鸢尾杂交后2～4 h,花粉大量萌发,花粉管伸长,出现扭曲盘绕现象(图1(a));授粉后4～6 h,花粉管伸长至柱头四分之一,柱头上胼胝质现象明显(图1(b));授粉后6～12 h,花粉管伸长至柱头底部,花粉管通道内可见大量胼胝质(图1(c));授粉后48 h,少量花粉管顺利到达胚珠(图1(d))。以鸢尾为母本,与有髯鸢尾杂交后4～6 h,花粉粒大量萌发,花粉管伸长至柱头二分之一处,并在柱头表面弯折(图1(e));授粉后6～12 h,花粉管伸长至柱头底部(图1(f));授粉后12～24 h,花粉管未到达胚珠(图1(g));授粉后48 h,少数花粉管到达胚珠(图1(h))。

(a)～(d)分别为有髯鸢尾‘1601’×鸢尾杂交授粉后4、6、12和48 h;(e)～(h)分别为鸢尾×有髯鸢尾杂交授粉后6、12、24和48 h。(a)-(d) are bearded iris ‘1601’×I. tectorum at 4,6,12 and 48 h after pollination,respectively;(e)-(h) are I. tectorum×bearded iris ‘1601’ at 6,12,24 and 48 h after pollination,respectively.

以有髯鸢尾为母本的组合花粉于授粉后2～4 h萌发,萌发时间比反交组合早,但花粉管前期生长速度相较而言较慢,2个组合授粉后48 h均有少量花粉管到达胚珠。二者均存在一定受精前障碍,分别在授粉后2～4与4～6 h出现,表现为花粉管异常行为和胼胝质反应。

2.1.2有髯鸢尾与西伯利亚鸢尾正反交组合花粉萌发与花粉管生长状况分析

以有髯鸢尾为母本,与西伯利亚鸢尾杂交后2 h,部分花粉粒萌发,花粉管在柱头表面弯折(图2(a));授粉后6 h,花粉管伸长至柱头三分之一,柱头上可见明显胼胝质现象(图2(b));授粉后12 h,花粉管伸长至柱头底部,但花粉管曲折明显(图2(c));授粉后48 h,未见花粉管伸入胚珠(图2(d))。以西伯利亚鸢尾为母本,与有髯鸢尾杂交后2 h花粉粒萌发,花粉管伸长并在柱头表面弯折缠绕(图2(e));授粉后12 h,花粉管伸长至柱头二分之一处,并出现反向生长现象(图2(f));授粉后24 h,花粉管到达柱头底部,花粉管通道内胼胝质反应明显(图2(g));授粉后48 h,花粉管到达胚珠(图2(h))。

(a)～(d)分别为有髯鸢尾×西伯利亚鸢尾杂交授粉后2、6、12和48 h;(e)～(h)分别为西伯利亚鸢尾×有髯鸢尾杂交授粉后2、12、24和48 h。(a)-(d) are bearded iris×I. sibirica at 2,6,12 and 48 h after pollination,respectively;(e)-(h) are I. sibirica×bearded iris at 2,12,24 and 48 h after pollination,respectively.

2个组合花粉均于授粉后2 h萌发,有髯鸢尾为母本的组合花粉管前期生长较其反交组合快,授粉后48 h仅观察到西伯利亚鸢尾为母本的组合花粉管与胚珠结合。二者合子前障碍明显,前者主要表现为花粉萌发率低、胼胝质反应及花粉管异常行为、生长停滞,后者主要表现为明显胼胝质反应及花粉管异常行为。

2.2 不同有髯鸢尾远缘杂交组合果实发育动态观测

有髯鸢尾与鸢尾杂交组合中,以有髯鸢尾为母本时,膨大子房在授粉后3～12 d生长较快,12 d后生长速度变缓,21 d后子房停止生长,部分子房外壁发黄,下部皱缩;以鸢尾为母本时,子房在授粉后3～15 d生长迅速,24 d后子房停止生长(图3)。有髯鸢尾与西伯利亚鸢尾杂交组合中,以有髯鸢尾为母本时,子房生长速度缓慢,在授粉6 d后停止生长,枯黄衰亡;以西伯利亚鸢尾为母本时,观察到子房在12 d后发黄脱落(图3)。

图3 有髯鸢尾系间不同杂交组合后代果实发育情况统计Fig.3 Statistics on fruit development of the offspring of different interseries crosses hybrids of Bearded iris

4个杂交组合中,以有髯鸢尾和鸢尾为亲本的组合子房发育状态较好,至24 d后停止发育,并出现大规模败育(图4);以有髯鸢尾和西伯利亚为亲本的组合子房发育较差,早期出现败育。

图4 有髯鸢尾与鸢尾杂交后胚珠败育Fig.4 Ovule abortion after crossing Bearded iris with I. tectorum

2.3 有髯鸢尾系间远缘杂交组合坐果率

有髯鸢尾与鸢尾正反交组合坐果率为36.41%～42.35%,有髯鸢尾与西伯利亚鸢尾正反交组合坐果率为1.81%～10.35%,前者坐果率高于后者。2个不同类型的系间杂交所有组合中,有髯鸢尾作父本时坐果率均高于其反交组合(表1)。

表1 有髯鸢尾系间远缘杂交组合坐果率统计Table 1 Fruit setting rate statistics of distant hybridization combinations in interseries crosses in bearded iris

2.4 胚拯救

将胚珠接种至MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基中培养30 d后,有髯鸢尾×鸢尾杂交组合有5个胚珠萌发,鸢尾×有髯鸢尾杂交组合有3个胚珠萌发;继续培养30 d获得有髯鸢尾×鸢尾组培苗;鸢尾×有髯鸢尾愈伤组织仍保持绿色。在MS+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培养基中,西伯利亚鸢尾×有髯鸢尾和鸢尾×有髯鸢尾组合有浅黄色愈伤组织生成,并继续诱导形成组培苗。

3 讨论与结论

鸢尾种间杂交中花粉及花粉管不亲和行为包括花粉附着困难、萌发率低、花粉管的异常行为和胼胝质反应[10-12]。有髯鸢尾与鸢尾、西伯利亚鸢尾系间远缘杂交组合中,除有髯鸢尾×西伯利亚鸢尾外,其余组合花粉管均可进入胚珠且均能坐果,说明各组合均能完成受精作用并生长发育,证明有髯鸢尾与饰冠鸢尾系间杂交及西伯利亚鸢尾×有髯鸢尾存在一定合子前障碍,但不是系间远缘杂交的关键障碍。荧光观察中有髯鸢尾×西伯利亚鸢尾花粉管未进入胚珠,且477个杂交个体里仅3个坐果,说明二者合子前障碍明显,可尝试通过提前授粉[10,13]和混合花粉授粉[14]等方式克服。

亲缘关系与系间杂交亲和性密切相关。有髯鸢尾与鸢尾正反交坐果率分别为36.41%和42.35%,有髯鸢尾与西伯利亚鸢尾其正反交组合坐果率较低,分别为1.81%和10.35%。子房动态观测表明,有髯鸢尾与西伯利亚鸢尾杂交组合子房在授粉后早期败育。因此,有髯鸢尾与西伯利亚鸢尾远缘杂交受精后障碍更明显且发生的时期早。有研究表明,杂交亲本亲缘关系越近,杂交成功可能性越大[2]。有髯鸢尾与西伯利亚鸢尾遗传关系较与鸢尾远,与受精后胚胎发育早期停止密切相关。

胚拯救可克服远缘杂交受精后障碍,获得远缘杂交的植株。利用胚拯救技术可获得鸢尾属远缘杂交后代,如对燕子花(IrisleavigataFisch.)×玉蝉花(IrisensataThunb.)授粉后60 d的胚珠进行胚珠培养,成功获得杂种后代[15];对黄菖蒲×喜盐鸢尾子房进行培养,获得膨大的胚珠并发育成种子[11]。动态观测果实发育,可从形态上判断胚珠败育时期,以确定胚拯救时期[16]。有髯鸢尾×鸢尾、鸢尾×有髯鸢尾和西伯利亚鸢尾×有髯鸢尾最佳胚拯救时期分别为授粉21、24和12 d后。

有髯鸢尾与鸢尾、西伯利亚类鸢尾进行远缘杂交,表明有髯鸢尾系间远缘杂交亲和性与亲缘关系呈正相关。胚拯救技术有助于获得有髯鸢尾系间远缘杂交后代,从果实发育过程判断胚珠败育时期,尚需从胚胎学角度进一步研究。经严格人工授粉和套袋杂交获得有髯鸢尾系间远缘杂交后代,仍需进行核型分析进一步鉴定,为有髯鸢尾育种开拓新领域。