2型糖尿病大鼠血清中蛋白结合态铜和锌水平的测定*

秦旭, 李军, 胡勇, 于春, 黄磊, 娄波, 罗茹丹, 徐纬

(贵州医科大学 公共卫生与健康学院 环境污染与疾病监控教育部重点实验室, 贵州 贵阳 550025)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种代谢异常所导致的高血糖病,DM的发病以2型DM(type 2 DM,T2DM)为主,1型DM(T1DM)和其它类型DM少见[1-2]。研究表明,铜(copper,Cu)、锌(zinc,Zn)等微量元素与T2DM关系密切,其增加或缺失都会使胰岛素的合成和释放受到影响[3-4]。既往研究中,学者们主要关注血清中微量元素总量与T2DM的关系,很少关注元素的形态[5-6]。微量元素在血清中的存在形态为蛋白结合态和非蛋白结合态,与蛋白质结合而存在的元素形态为蛋白结合态元素,其它存在形态的元素均为非蛋白结合态元素[7]。与非蛋白结合态元素相比,元素蛋白结合态在机体内发挥的生物学作用更稳定[7]。因此,相较于测定元素总形态含量而言,检测血清中蛋白结合态元素含量更能准确反映元素在T2DM发生发展过程中的作用,对T2DM的辅助诊断和治疗具有更重要的价值。蛋白结合态元素与T2DM的关系的研究比较缺乏,因此,本研究以T2DM大鼠为研究对象,采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法(atomic absorption spectroscopy,AAS)检测T2DM大鼠血清中Cu、Zn蛋白结合态含量,初步探讨Cu、Zn元素的蛋白结合态在T2DM大鼠元素含量分析中的价值,可供临床T2DM的诊疗和基础研究时参考使用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1动物来源 清洁级成年Sprague Dawley(SD)健康大鼠30只,雌雄各半,体质量180～220 g,由学校实验动物中心提供[SYXK(黔)2018-0001]。

1.1.2主要仪器与试剂 连续光源火焰-石墨炉原子吸收光谱仪(德国耶拿conntraa700),离心机(上海卢湘仪TGL-16.5M),电子天平(梅特勒HZT-B2000),血糖仪(珠海柯诺S286);Cu、Zn单元素标准储备溶液1 000 mg/L(国家有色金属中心),硝酸(优级纯,重庆川东化工),无水乙醇(优级纯,天津市鑫宇精细化工),链脲佐菌素(streptozocin,STZ;上海皓鸿),柠檬酸和柠檬酸三钠(上海MACKUN)。

1.2 检测方法

1.2.1造模及分组 参考文献[8]建立T2DM大鼠模型。采用随机数字表法将大鼠随机分为对照组(雌雄各5只,普通饲料喂养)和T2DM模型组(雌雄各10只,高糖高脂饲料喂养),喂养4周;对照组大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液,T2DM模型组腹腔注射35 mg/kg的STZ且诱导5 d;空腹采集2组大鼠尾静脉血液检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),取3次平行FBG检测的均值,以FBG≥11.1 mmol/L作为成模标准。

1.2.2取样 取“1.2.1”项下2组大鼠心脏血,静置30 min,于4 ℃下12 000 r/min离心10 min取血清,分别放入1.5 mL离心管内,储存于-80 ℃超低温冰箱内待检。

1.2.3样品检测 取“1.2.1”项下2组大鼠血清100 μL加入离心管中,加硝酸17 μL,混匀静置10 min,蒸馏水稀释至1 mL,充分混匀,采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定Cu、Zn含量;再取2组大鼠血清100 μL加入1.5 mL离心管内,分别加70%(V/V,下同)的乙醇400 μL混匀,静止5 min,4 ℃下12 000 r/min离心10 min,上清液用0.45 μm一次性水系过滤器过滤,取滤液300 μL,加1%硝酸700 μL,充分混匀,采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定Cu、Zn含量;Cu、Zn元素总形态含量与非蛋白结合态含量之差即为蛋白结合态含量。

1.2.4标准储备溶液的配置 取1 000 mg/L的Cu、Zn标准储备液各1 mL,1%硝酸稀释,定容到100 mL容量瓶中,摇匀,配成10 mg/L的标准储备液;取10 mg/L的Cu、Zn标准储备液各3 mL,定容到100 mL的容量瓶中,摇匀,配成300 μg/L的标准储备液。

1.2.5标准曲线 用1%的硝酸作为稀释液,仪器自动将“1.2.4”项下300 μg/L的Cu、Zn标准储备液稀释为0、20、60、140、220及300 μg/L的单元素标准质量浓度溶液系列。

1.2.6检出限和定量限 按“1.2.3”项下的实验方法制备空白溶液,根据仪器工作条件连续测量11次,分别以测定值的3倍和10倍标准偏差值(S)除以标准曲线的斜率(k)得到各元素含量的检出限(3 s/k)和定量限(10 s/k)。

1.2.7精密度实验 按“1.2.3”项下的方法分别制备6份对照组大鼠血清Cu、Zn元素总形态和非蛋白结合态元素血清样品,根据仪器工作条件进行测定,计算Cu、Zn总含量、非蛋白结合态含量及相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.8回收实验 取“1.2.2”项下对照组大鼠血清制备均质血清50 μL和100 μL各12份,各自均分为4组;取50 μL和100 μL的血清各1组,按“1.2.3”项下的实验方法分别处理为对照组大鼠血清Cu、Zn元素总形态样品和非蛋白结合态样品,采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定血清本底值,测定值分别取均数即为总形态样品和非蛋白结合态样品本底值;另取血清50 μL分为3组,按加标量为本底值比加标值低(1∶0.5)、中(1∶1.0)及高(1∶1.5)的3个比例进行加标,后续步骤按“1.2.3”项下的实验方法进行,采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定3组血清Cu、Zn元素含量;取剩余100 μL血清3组,加标量同上,后续步骤按“1.2.3”项下实验方法进行,采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定加标后3组血清Cu、Zn元素含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 标准曲线、检出限和定量限

把Cu、Zn的质量浓度作为横坐标、吸光度作为纵坐标、绘制标准曲线,结果表明,标准曲线的相关系数均在0.999以上,Cu、Zn标的质量浓度均在0～300 μg /L内与对应的吸光度呈线性关系,Cu、Zn元素线性关系良好,该标准曲线对待测元素可以准确定量。见表1。

表1 Cu、Zn元素线性参数、检出限和定量限Tab.1 Linear parameters, limits of detection, and quantification of Cu and Zn elements

2.2 精密度和回收率

采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定对照组大鼠血清Cu、Zn元素总形态样品含量和非蛋白结合态含量,对对照组大鼠血清Cu、Zn元素总形态样品含量和非蛋白结合态含量进行精密度和加标回收率实验,并计算测定值的RSD和加标回收率,结果表明,Cu、Zn元素总形态含量和非蛋白结合态含量RSD测量值均小于5%;Cu、Zn元素总形态和非蛋白结合态低、中、高加标回收率的范围为87%～110%,能满足加标回收率范围80%～120%的要求。见表2。

表2 Cu、Zn元素总形态含量和非蛋白结合态精密度和回收率实验结果Tab.2 Experimental result of total morphological content of Cu and Zn elements as well as precision and percent recovery of non-protein bound states

2.3 血清中不同形态Cu、Zn元素的含量

结果显示,与对照组相比,T2DM模型组大鼠血清Cu总形态含量和蛋白结合态含量均升高(P<0.05),但非蛋白结合态含量无变化(P>0.05);与对照组相比,T2DM模型组大鼠Zn总形态含量和蛋白结合态含量均降低(P<0.05),但非蛋白结合态含量变化无差异(P>0.05)。见表3。

表3 对照组和T2DM模型组大鼠血清中不同形态Cu、Zn的含量Tab.3 Amount of Cu and Zn in the serum of control and T2DM model rats

2.4 血清中不同形态Cu、Zn含量的比值

结果显示,与对照组相比,T2DM模型组大鼠血清中Cu和Zn总形态含量和蛋白结合态含量比值均升高(P<0.05),但非蛋白结合态Cu和Zn含量比值变化无差异(P>0.05)。见表4。

表4 对照组和T2DM模型组大鼠血清不同形态Cu/Zn比值Tab.4 Ratio of serum Cu and Zn in different forms between control group and T2DM

2.5 血清中不同形态Cu、Zn含量的相关性

结果显示,所有大鼠血清中Cu总形态含量和蛋白结合态含量与Zn总形态含量和蛋白结合态含量呈负相关关系(P<0.05),而非蛋白结合态Cu含量与非蛋白结合态Zn无相关性(P>0.05)。见表5。

3 讨论

T2DM作为一种严重影响人群健康的慢性非传染性疾病,一旦患病无法治愈[9-10]。随着经济的发展,人民生活水平的提高,生活方式改变以及人口老龄化,我国DM患病率快速增长,增长速度高于亚洲其它国家,给社会带来沉重的负担[11-12]。根据调查数据显示,我国成人DM患病率已经达到12.8%,患者总人数也已经达到了1.298亿[12-13]。Cu、Zn是人体不可或缺的必要营养物质,对胰岛素的合成、分泌、贮存、活性以及能量代谢起着重要作用[14-15]。既往研究主要通过检测血清中元素总形态含量来研究机体元素代谢水平,但由于血清中元素总形态含量易受到饮食、环境等因素的影响[4-5];此外,关于患者或T2DM大鼠血清中Cu、Zn总形态含量研究结果并不统一,存在一定程度的偏差[16-17],而元素的蛋白结合形态相对稳定,不易受到上述因素的影响。因此,分析T2DM血清中元素蛋白结合态含量对进一步探明元素与T2DM的关系具有重要的价值。

本研究以T2DM大鼠为对象,采用连续光源火焰-石墨炉原子吸收光谱仪检测T2DM大鼠血清中Cu、Zn总形态含量和非蛋白结合态元素含量,从元素蛋白结合态的角度分析大鼠血清中Cu、Zn含量与T2DM发生和发展的关系,结果显示,T2DM大鼠血清中Cu总形态含量升高,Zn总形态元素含量降低,Cu、Zn总形态元素含量比值升高,Cu总形态元素含量与Zn总形态元素含量呈负相关关系,提示T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素出现紊乱。相关研究表明,铜在机体中参与了多种酶活性及生物代谢,主要以结合铜蓝蛋白的形式影响生物代谢,锌与2型糖尿病的关系非常密切,直接参与了人体内胰岛素的合成、储存及分泌[5];Zn元素分布在胰岛β细胞颗粒中,能够提高胰岛素的稳定性,并调节胰岛素降糖作用[18];Zn主要靠金属硫蛋白缓冲体系保持动态平衡,当T2DM发生时,机体内肠道中Cu元素的吸收率提高、积蓄量增加,与Zn元素竞争同一载体蛋白-金属硫蛋白并产生拮抗作,导致Zn元素含量减少,进而引起T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素紊乱[19-20]。提示T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素出现紊乱可能与蛋白结合态的元素有关。

进一步分析T2DM大鼠血清中Cu、Zn非蛋白结合态元素含量,发现T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素含量无明显变化,Cu、Zn非蛋白结合态元素含量比值亦无明显变化,Cu非蛋白结合态元素含量与Zn非蛋白结合态元素含量也无明显的相关性,提示T2DM大鼠血清中Cu、Zn非蛋白结合态含量未发生紊乱。相关研究表明,不同元素的化学形态生物效应差别很大,它们决定了元素在生物体内的化学行为,表现出不同的生物学效应,元素蛋白结合态相较于非蛋白结合态在体内比较稳定且发挥着重要的生物学作用,如有铜蓝蛋白(抗氧化剂作用)、血蓝蛋白(运输氧)、超氧化物歧化酶(歧化反应)、血红蛋白(运输氧)等[21]。由此推测,在大鼠T2DM的发生过程中,非蛋白结合元素可能未发挥主要的生物效应,可能与大鼠T2DM的发生无直接的关联。

结合元素总形态和非蛋白结合态元素含量的研究结果,分析元素蛋白结合态研究结果显示,T2DM大鼠血清中Cu蛋白结合态含量升高,Zn蛋白结合态含量降低,Cu、Zn蛋白结合态元素含量比值升高,Cu蛋白结合态元素含量与Zn蛋白结合态元素含量呈现负相关关系,提示T2DM大鼠血清中蛋白结合态Cu、Zn元素发生紊乱,T2DM大鼠血清中总形态元素Cu、Zn的紊乱是由于蛋白结合态Cu、Zn元素的紊乱引起。相关研究显示,Zn与2型糖尿病的关系非常密切,直接参与了人体内胰岛素的合成、储存及分泌[5];Zn在细胞中大部分与蛋白紧密结合,只有一小部分以游离形式存在,到目前为止,已发现300多种Zn活化的金属蛋白酶和2 000多种Zn依赖性转录因子[22];人体内Zn稳态主要靠金属硫蛋白/硫蛋白缓冲体系、Zn转运蛋白和Zn-铁转运体蛋白家族两大Zn转运系统[19-20],金属硫蛋白/硫蛋白缓冲体系重点参与Zn的跨膜转运,而Zn转运蛋白和Zn-铁转运体蛋白家族主要参与Zn的储存及运输[19];金属硫蛋白是具有抗氧化特性的Zn结合蛋白,可以保护细胞和组织免受氧化应激,其表达可降低高血糖诱导的器官中的氧化应激、糖尿病并发症风险[21]。另有研究表明,铜在机体内主要以结合铜蓝蛋白的形成存在,与了多种酶活性及生物代谢,Cu与Zn在人体中相互拮抗,如果体内Cu元素增多,则会影响Zn元素的吸收使其大量丢失,促使糖尿病及其并发症的发生和发展[3]。由此推测,在大鼠T2DM发生过程中,蛋白结合形态Cu、Zn元素在大鼠T2DM发生过程中发生了显著变化。

综上所述,T2DM大鼠血清中Cu、Zn总形态的变化主要是由蛋白结合态变化引起,与非蛋白结合态含量变化无直接关联,蛋白结合形态Cu、Zn元素在大鼠T2DM发生过程中发挥了重要的生物学作用。以上研究结果提示,下一步研究工作应重点关注元素的蛋白结合态的含量变化,可忽略元素非蛋白结合态含量变化。