银翘解毒片中掺伪山银花成分监测*

刘益庆，吴琦，赵猛，陈洪岩，钱明明，李玲

连云港市食品药品检验检测中心，连云港222006

银翘解毒片收载于《中国药典》2020 年版一部，由金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子（炒）、桔梗、淡竹叶、甘草九味药组成，具有疏风解表、清热解毒的功效[1]。《中国药典》2005 年版开始将金银花和山银花分列为两个标准，金银花为单一来源，即忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）；山银花有4种植物来源，分别为忍冬科植物灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.）、红腺忍冬（Lonicera hypoglaucaMiq.）、华南忍冬（Lonicera confusaDC.）或黄褐毛忍冬（Lonicera fulvoto-mentosaHsu et S.C.Cheng）。金银花和山银花外观性状差异较大，但投料制成中成药后却难以辨别，由于山银花较金银花产量大、价格低，因此市场上金银花中掺杂山银花现象屡见不鲜。金银花与山银花为近缘植物，两者都含有绿原酸，但作为药用成分的木犀草苷，金银花中含量较高，而山银花中含量很少。此外，由于山银花含有大量的皂苷类成分，临床上存在溶血致敏的风险。通过查阅文献，金银花中掺伪山银花的检验方法有显微特征鉴别[2]、薄层色谱法[3]、DNA 条形码技术[4]、近红外光谱技术[5]、高效液相色谱法[6，7]、高效液相色谱-质谱联用方法[8，9]等，本文拟通过优化分析方法，建立科学准确高效普及的检验方法用于检测银翘解毒片中掺伪山银花的成分。

1 仪器与试药

Vanquish 型高效液相色谱仪（电喷雾检测器，美国赛默飞公司）；BP211D 型电子天平（德国赛多利斯公司）；1290-6470 Triple Quad 超高效液相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；UV240型紫外分光光度计（日本岛津公司）。

灰毡毛忍冬皂苷乙对照品（批号111814-202106，含量96.1%），川断续皂苷乙（批号111813-201804，含量96.8%），山银花对照药材（批号121595-201202），金银花对照药材（批号121060-201608）均购自中国食品药品检定研究院；银翘解毒片42 批（A 企业200201、200301、200401、210202、210801等，B 企业19910001、19910002、199910003，C 企业 1201001、1201002、1201003等，D 企业20210469、20210868等，E 企业21122922，F 企业410270、410320等，G 企业202101、202102、202103等，H 企业18005，I 企业200102等，J 企业190703、200602 等）；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯（德国Merk 公司）；纯净水由Milli-Q 纯水仪制备。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

对照品溶液：取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品约12 mg、川续断皂苷乙对照品约10 mg，精密称定，置于100 mL 量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。

山银花对照药材溶液：取山银花对照药材约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，50%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

金银花对照药材溶液：取金银花对照药材约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，50%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液：取本品10片，研细，取约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，50%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

掺入3%山银花、掺杂5%山银花溶液：根据银翘解毒片处方和制法，分别按3%、5%比例掺入山银花投料，制成掺入不同投料比例山银花的模拟样品，按照“供试品溶液”制备。

2.2 色谱条件

色谱柱为Superiorex ODS C18（250mm×4.6 mm，5 μm），流速为1.0 mL·min-1，以乙腈为流动相A，水为流动相B，行梯度洗脱：0～10.0 min，20%→30%A；10.0～25.0 min，30% A；25.0～36.0 min，30%→20%A，柱温30℃，进样量10 μL。电喷雾检测器条件：雾化器温度45℃，采集频率10 Hz，滤光片10.0 s；理论板数按灰毡毛忍冬皂苷乙峰计算应不低于5000。

2.3 专属性考察

分别取“2.1”项下的对照品溶液、山银花对照药材、金银花对照药材、供试品溶液按“2.2”项下色谱条件进行检测。结果（图1）表明，在与灰毡毛忍冬皂苷乙对照品和川续断皂苷乙对照品色谱保留时间相同的位置上，山银花对照药材检出相应色谱峰，而金银花对照药材未检出相应色谱峰，表明采用灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙作为区分山银花与金银花的特征成分是可行的。掺伪山银花的银翘解毒片色谱图中检出灰毡毛忍冬皂苷乙成分，而正常的银翘解毒片色谱图中未检出灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙成分。

图1 山银花对照药材（A）、金银花对照药材（B）、混合对照品（C）、掺伪样品（D）及正常样品（E）HPLC-CAD 色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液2、5、10、15、20、30、60 μL，依次进样分析，记录峰面积，以进样量（μg）的常用对数为横坐标，以峰面积的常用对数为纵坐标进行线性回归，灰毡毛忍冬皂苷乙的回归方程为：Y1=1.598 5X1+4.587 2，r=0.999 2；川续断皂苷乙的回归方程为：Y2=2.260 8X2+1.806 9，r=0.999 3；结果表明：灰毡毛忍冬皂苷乙在0.239～7.158 μg、川续断皂苷乙在0.202～6.066 μg 范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取线性关系中间浓度的对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件重复进样6次，结果灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙峰面积的RSD 分别为0.86%和1.02%（n=6）。

2.6 重复性试验

取掺伪样品（厂家A，批号200201），按“2.1”项下方法平行制备6份，按“2.2”项下色谱条件测定灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙含量，结果其浓度的RSD 分别为0.98%和1.15%（n=6）。

2.7 稳定性试验

取“2.6”项下供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h 进样，结果灰毡毛忍冬皂苷乙和川断续皂苷乙峰面积的RSD 为1.27%和1.33%（n=6）。

2.8 耐用性试验

取“2.6”项下供试品溶液，分别选择3 根长度和粒径均为250 mm 和5 μm 不同厂家色谱柱（Superiorex ODS C18、Phenomenex Luna C18、Welch Ultimate XB-C18），按照“2.2”项下色谱条件检测，结果灰毡毛忍冬皂苷乙保留时间和峰面积的RSD 分别为0.41%和1.03%，川续断皂苷乙保留时间和峰面积的RSD 分别为0.56%和1.48%。

2.9 加样回收率试验

称取已知含量的掺伪样品（厂家A，批号200201）约0.6 g 9份，分别加入灰毡毛忍冬皂苷乙对照品和川续断皂苷乙对照品适量，按“2.1”项下方法制备，按“2.2”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1～2。

表1 灰毡毛忍冬皂苷乙回收率试验

表2 川续断皂苷乙回收率试验

3 样品含量测定

取3 批掺伪样品（厂家A，批号200201、210202、210801），按“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下的色谱条件进行测定：结果测得灰毡毛忍冬皂苷乙含量分别为8.412、6.978、7.491 mg·g-1；川续断皂苷乙含量分别为0.742 7、0.701 6、0.712 2 mg·g-1。

4 质谱确认

对检出的11 批掺伪样品做质谱确认，通过ESI+扫描，灰毡毛忍冬皂苷乙一级质谱m/z 为1 397.66，以m/z 1 397.66 为母离子的二级质谱有1 073.55、911.48，见图2A～D；川续断皂苷乙一级质谱m/z 为1 057.66，以m/z 1 057.666 为母离子的二级质谱有619.41、455.35，见图2E～H。

图2 灰毡毛忍冬皂苷乙对照品一级（A）、二级（B），样品一级（C）、二级（D）质谱图；川续断皂苷乙对照品一级（E）、二级（F），样品一级（G）、二级（H）质谱图

5 讨论

流动相曾摸索过0.1%甲酸-乙腈、0.1%三氟乙酸-乙腈、水-乙腈，三者专属性一样，从环境考虑，选择水-乙腈系统。供试品提取方法曾摸索过甲醇、乙腈、50%甲醇、乙醇等，采用超声和加热回流两种方式，时间选择10、30 和60 min，最终确定50%甲醇超声30 min 最为合适。掺入3%山银花和掺入5%山银花作为正常样品和掺伪样品的判定依据，《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则0212 药材和饮片检定通则中规定：药屑及杂质不得过3%，基于中成药的处方和工艺，本文分别考察掺入3%山银花和5%山银花供试品中灰毡毛忍冬皂苷乙的检测限，结果掺入3%山银花供试品未检出，掺入5%山银花供试品检出，在42 批样品中检出11 批掺伪成分。同时，与HPLC-ELSD 法相比，HPLC-CAD 法检测的响应值和灵敏度更优。

选择四级杆飞行质谱串联，在定性鉴别上分辨率高，专属性强，一级质谱和二级质谱的质荷比（m/z）可精确到小数点后4 位。