血清miR-205 联合sCD40L 检测对老年创伤性骨折术后DVT 的预测价值分析

苏智慧 张雷

（河南省南阳文和骨科医院脊柱关节科 南阳 474250）

深静脉血栓（Deep Vein Thrombosis,DVT）是创伤性骨折术后常见并发症之一，其发生机制与血流速度缓慢、血管内皮细胞受损及凝血功能异常有关，尤其是创伤性骨折老年患者下肢血管壁肌力减低、血流速度和血液回流能力减弱易造成血管内皮损伤，进而激活内源性凝血机制，加之老年患者多合并高血压、糖尿病等基础疾病更易诱发DVT[1]。若不能及时诊断和治疗，可能引起肺栓塞，这也是导致住院患者致残、致死的重要原因之一。随着分子靶向治疗成为临床新的突破方向和热点，多项研究表明，微小RNA（miR）通过调节细胞分化、增殖、凋亡等多种作用机制，参与DVT 的发生发展过程[2]。miR-205 作为一种小分子非编码RNA，被证实在DVT 患者单核细胞中呈高表达，但目前国内外关于miR-205 与创伤性骨折术后DVT 形成的相关性研究甚少，缺乏可靠参考依据。另外，相关研究表明，炎症反应是启动DVT 形成的重要因素，而可溶性细胞表面分化抗原40 配体（Solublecell Surface Differentiation Antigen 40 Ligands,sCD40L）作为炎症反应的关键分子，具有显著的促炎和促凝作用[3]。因此推测sCD40L 可能在创伤性骨折术后DVT 形成过程中扮演着重要角色。鉴于此，本研究选取120 例创伤性骨折患者及50 名健康志愿者为研究对象，检测其血清miR-205、sCD40L 的表达水平，旨在探讨血清miR-205 联合sCD40L 检测对老年创伤性骨折术后DVT 形成中的预测价值。现报道如下：

以贵州黔西项目为例，通过评估，该方案产生的人力成本、时间成本约是方案二的3倍。特别对于工期紧张的项目，可行性较低。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2020年1月南阳文和骨科医院收治的创伤性骨折患者120 例，其中男73 例，女47 例；年龄60～78 岁，平均（68.12±3.26）岁；创伤原因：交通事故伤53 例，坠落伤30 例，跌打伤21 例，其他16 例；骨折类型：四肢骨折58 例，脊柱骨折45 例，骨盆骨折17 例。另选取同期50 名健康志愿者为对照组，其中男31 例，女19 例；年龄60～81 岁，平均（68.25±3.40）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究获取医院医学伦理委员会批准。

1.2 DVT 诊断标准 参照《深静脉血栓形成的诊断和治疗指南（第三版）》[4]相关诊断标准，且术后经彩色多普勒超声检查确诊。彩超结果判定标准：（1）下肢静脉管腔显著增粗，管腔内无回声或低回声；（2）血栓处无血流信号或自主性、激惹性血流；（3）形成侧支循环、对Valsalva 运动反应减弱或消失。根据患者术后是否发生DVT，将纳入的120 例创伤性骨折患者分为DVT 组（n=45）和非DVT 组（n=75）。

1.3 入组标准 纳入标准：均经CT 等影像学检查确诊为创伤性骨折；均为新鲜骨折，且接受手术治疗；年龄≥60 岁，临床资料完整；患者均知情，并自愿参与本研究。排除标准：病理性、陈旧性骨折者；合并骨恶性肿瘤者；术前合并DVT 者；近期有外科手术史或服用影响凝血功能药物者；合并严重脏器功能不全者；合并严重感染、出血性疾病者；肢体功能障碍，长期卧床者；合并精神系统疾病、不能配合研究者。

1.4.1 标本采集 所有受检者在空腹状态下采集肘正中静脉血清标本3～5 ml，置于抗凝管中，以离心半径10 cm、离心转速3000 r/min，离心10 min，留取上层血清。

1.4 研究方法

2.1 三组血清miR-205、sCD40L 水平比较 DVT组血清miR-205、sCD40L 水平高于非DVT 组和对照组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

已有大量关于ENSO与中国夏季降水关系的工作(叶愈源,1988;Huang and Wu,1989;金祖辉和陶诗言,1999;赵亮等,2006)。研究表明东亚夏季风降水可能与ENSO循环的阶段性有关,并建立ENSO与中国夏季降水的时滞相关模型,将其应用于业务预报,取得了一定成效。但ENSO 与中国夏季降水的关系具有不稳定性(宗海峰等,2010)。中国夏季降水异常可能与El Nio事件的强度(薛峰和刘长征,2007)、与El Nio事件发生时最大暖海温的位置(张志华和黄刚,2008;Feng et al.,2011;郭栋等,2016)有关。

2.2 血清miR-205、sCD40L 检测对老年创伤性骨折患者术后发生DVT 的诊断价值 血清miR-205、sCD40L 诊断老年创伤性骨折患者术后发生DVT的曲线下面积（AUC）分别为0.901、0.855，灵敏度为82.2%、75.6%，特异度均为85.3%；血清miR-205 联合sCD40L 诊断老年创伤性骨折患者术后发生DVT 的AUC 为0.961，灵敏度为90.1%，特异度为94.7%，均高于上述指标单独检验（P＜0.05）。见图1、表2。

DVT 是在多种因素影响下导致凝血系统异常激活而形成的血栓栓塞性疾病，由于其缺乏特异性临床症状，因此早期诊断较为困难，容易出现误诊和漏诊。既往临床针对DVT 诊断方法较多，但均具有一定的局限性，其中床边超声虽操作便捷，但诊断准确度及灵敏度有所欠缺，且易受主观操作等因素影响；肺动脉增强CT 及下肢血管造影诊断准确率高，但价格昂贵，不可作为常规辅助检查手段[5～6]。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计学软件处理数据。计数资料以%表示，采用χ2检验；计量资料以（x±s）表示，采用t、F检验；采用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清miR-205、sCD40L 单独及联合检测对老年创伤性骨折术后发生DVT 的诊断灵敏度、特异度。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

1.4.2 血清miR-205 检测 采用实时荧光定量PCR 法（qRT-PCR）测定血清miR-205 表达，取上述血清标本采用TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司提供）提取血清总RNA；采用RT-PCR 试剂盒（美国Biomiga 公司提供）将其逆转录为cDNA，以U6 作为内参基因；采用ABI7500 型荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司提供）进行qRT-PCR 实验，miRNA 总反应体系：10 μl，包括5 μl SYBR，0.8 μl RNA 模板，0.2 μl TaqDNA 聚合酶，3 μl DEPC。反应条件：95℃5 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，40 个循环，每个样品设3 个复孔。采用2-△△CT法进行分析，计算miR-205 基因相对表达量。引物序列如下，上游：5'-AGAACTTATACTGAGTGAGG-3'， 下 游 ：5'-GAAGTCAAGATCGAATTG-3'。

表1 三组血清miR-205、sCD40L 水平比较（±s）

表1 三组血清miR-205、sCD40L 水平比较（±s）

注：与对照组比较，#P＜0.05；与非DVT 组比较，*P＜0.05。

组别nmiR-205sCD40L（ng/L）对照组非DVT 组DVT 组507545 F P 1.00±0.151.52±0.23#2.08±0.39#*197.0160.000108.45±30.06176.53±46.68#261.23±65.77#*116.7750.000

1.4.3 血清sCD40L 检测 取上述血清标本，采用Victor X 型多功能酶标仪（美国Perkinelmer 公司提供），以酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清sCD40L水平，试剂盒均购自武汉赛培生物，操作严格按照说明书进行。

图1 血清miR-205、sCD40L 检测诊断老年创伤性骨折患者术后发生DVT 的ROC 曲线

表2 ROC 曲线分析血清miR-205、sCD40L 单独及联合检测对老年创伤性骨折患者术后发生DVT 的诊断价值（±s）

表2 ROC 曲线分析血清miR-205、sCD40L 单独及联合检测对老年创伤性骨折患者术后发生DVT 的诊断价值（±s）

指标AUC（95%置信区间）P最佳临界值灵敏度（%）特异度（%）约登指数miR-205 sCD40L联合检测0.901（0.837～0.965）0.855（0.784～0.927）0.961（0.927～0.994）0.0000.0000.0001.75220.08-82.275.690.185.385.394.70.6750.6090.836

3 讨论

陕西关中冬季往往干旱寒冷，梨黑星病菌主要以菌丝和分生孢子在病梢、芽鳞和病枝上，或残存在落叶上越冬。在冬季温暖潮湿年份，分生孢子易丧失生活力而不能越冬，但病菌转而在落叶上形成菌丝团（12月）及子囊壳（1—2月）越冬，翌春再产生子囊孢子进行初次侵染。由于病菌能否形成子囊壳主要决定于冬季的湿度，因此在不同年份、不同地区，甚至同一地区不同小环境中，均可有不同的越冬方式。

对比三大断裂的赋矿标高、矿体规模、倾角变化、热液来源、矿石类型，认为其受相同应力场控制，处于同一构造系统内，形成了对矿体赋存空间的约束，成矿特征高度一致，矿体的水平赋存深度和矿体规模也具有一致性，因此提出了“胶西北三大断裂赋矿深度对称和矿体规模对称成矿”的找矿新思路，并在招平断裂水旺庄矿区进行验证，首次将勘查深度从-1500m延伸至-2200m以上，新增金资源量 110t ,至此招平断裂提交金资源量达 1080t ,成为千吨级控矿断裂。

随着临床研究的不断深入，多项研究表明，不同种类的miR 在DVT 外周血中呈高表达或低表达现象，而miR 又对DVT 的严重程度和血栓范围具有调控作用[7～8]。miR-205 位于第一号染色体LOC642587 位点上，可调控机体细胞中参与细胞代谢、分化等过程中相关基因表达，在多种疾病中异常表达。目前，临床关于血清miR-205 在DVT 发生发展中的作用和潜在机制尚未完全阐明。Sun 等[9]研究表明，血清miR-205 过表达可增强内皮祖细胞体内和体外血管生成、迁移、侵袭等，并抑制细胞凋亡。推测血清miR-205 可能通过靶向PTEN 调节Akt/ 自噬通路和MMP2 表达，参与DVT 发生发展。本研究结果显示，DVT 组血清miR-205 水平高于非DVT组和对照组（P＜0.05）。说明血清miR-205 相对表达水平升高参与了DVT 的发生与发展，可作为诊断老年创伤性骨折术后发生DVT 的有效指标。

当机体血管局部缺血、缺氧时，血管内皮细胞被诱导激活，导致大量黏附因子表达，继而启动内源性和外源性凝血途径，促进血栓进一步形成[10]。sCD40L 是一种血小板衍生介质，广泛分布于单核细胞、巨噬细胞等多种细胞膜上，可与B 淋巴细胞上的受体CD40 结合，发挥显著的促炎和促凝作用。杜果城等[11]研究表明，与健康对照组相比，DVT 组患者外周血中sCD40L 表达水平显著升高，且随病情进展sCD40L 表达呈上升趋势。王晓萌等[12]通过探讨血清sCD40L 在产褥期下肢DVT 评估中的应用价值，结果发现血清sCD40L 水平增高，且与DVT 风险分级增加有关。本研究结果显示，DVT 组血清sCD40L 水平高于非DVT 组和对照组（P＜0.05），与上述文献报道一致。说明sCD40L 在老年创伤性骨折术后合并DVT 患者外周血中呈高表达。考虑原因可能是：sCD40L 通过与靶细胞CD40 受体结合，激活下游核因子-κB 信号通路，进而参与血管紧张素-Ⅱ依赖性炎症反应和DVT 形成机制[13]。另外，本研究经ROC 曲线分析显示，血清miR-205 联合sCD40L 诊断老年创伤性骨折患者术后发生DVT 的AUC 为0.961，灵敏度为90.1%，特异度为94.7%，均高于上述指标单独检测。说明血清miR-205 联合sCD40L 可作为老年创伤性骨折患者术后DVT 高危人群早期筛查和诊断的生物学标志物。

综上所述，血清miR-205、sCD40L 在老年创伤性骨折术后DVT 患者中表达水平显著升高，两者联合检测能提高DVT 的诊断效能。