Akt、CCND1 通路相关蛋白在甲状腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性研究

张福汉 管瑛瑛 陈桓 许建芳

（复旦大学附属中山医院厦门医院 福建 厦门 361006）

甲状腺癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一，属于一种起源于甲状腺滤泡上皮或滤泡上皮细胞的恶性肿瘤。已有研究证实，甲状腺癌的发生与发展受到不同的癌基因及多种生长因子影响，且发病机制与原癌基因序列的过度表达、突变或缺失等密切相关[1]。肿瘤的侵袭、转移已被认为是致癌症患者死亡的主要原因之一，其中细胞周期调控在肿瘤侵袭、转移过程中发挥重要作用[2]。组织蛋白激酶B（Akt）是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在细胞增殖转录及细胞迁移等多种细胞过程中发挥重要角色。Akt可通过与多个信号通路的联系，从而参加细胞周期进程、分化及迁移，也是重要的信号节点[3]。细胞周期素D1（CCND1）是细胞调控中重要的调控因子，是细胞周期中G1 期进入S 期调控细胞增殖的关键点，而该点调控异常被认为与肿瘤的发生、发展关系密切[4]。已有临床研究表明，CCND1 在乳腺癌、肝癌、胃癌、鼻咽癌等恶性肿瘤中呈高表达，可能与治疗疗效及预后密切相关[5]。本研究前瞻性选取医院收治的100 例甲状腺癌患者为研究对象，测定甲状腺癌组织与配对癌旁组织中Akt、CCND1 通路相关蛋白的表达水平，分析甲状腺癌组织中Akt、CCND1通路相关蛋白表达水平与临床病理特征的相关性。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 前瞻性选取医院2019年8月至2022年8月收治的甲状腺癌患者100 例为研究对象，其中男33 例，女67 例；年龄24～68 岁，平均（44.32±7.48）岁；体质量指数22.6～30.3 kg/m2，平均（24.76±2.31）kg/m2；病理类型：乳头状癌63 例，滤泡癌28 例，髓样癌9 例；分化程度：高分化27 例，中分化48 例，低分化25 例；临床分期：Ⅰ期21 例，Ⅱ期34 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期17 例。本研究经复旦大学附属中山医院厦门医院医学伦理委员会批准（批号：伦理字201800116 号）。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：（1）符合甲状腺癌诊断标准[6]，且经临床实验室检查确诊；（2）年龄≥18 岁；（3）对本研究内容知情，自愿参与并签署知情同意书；（4）接受病理检查。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤者；（2）严重心、肝、肾等脏器功能不全者；（3）合并严重自身免疫系统功能障碍者；（4）伴有凝血功能障碍者；（5）严重精神及认知功能障碍者。

1.3 Akt、CCND1 通路相关蛋白检测 取患者甲状腺癌及癌旁组织进行检测：将甲状腺癌组织及癌旁组织样本经甲醛溶液固定后，用石蜡包埋，并将其切成4 μm 厚度的切片；经脱蜡处理后，使用梯度浓度酒精溶液进行脱水处理；使用pH 6.0 的枸橼酸盐缓冲液对切片进行浸泡修复抗原；再将切片放置在3%过氧化氢溶液中（室温下）孵育10 min，孵育完成后使用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline,PBS）进行3 次洗涤，使用封闭液封闭；将每份切面分别加入50 μl 鼠抗人Akt 抗体、CCND1 蛋白，放大倍数为1:2000，以4℃温度进行孵育过夜，经PBS洗涤后加入抗体（兔抗鼠Akt、CCND1），放大倍数为1:5000，孵育1.5 h；使用DAB 显色试剂盒进行显色处理，采用中兴树胶进行封片，于显微镜下观察。若阳性细胞数＜10%则记0 分，10%≤阳性细胞数≤25%记1 分，25%＜阳性细胞数≤50%记2 分，50%＜阳性细胞数≤75%记3 分，阳性细胞数＞75%则记4 分；染色情况，无着色记0 分，淡黄色记1 分，棕黄色记2 分，褐色记3 分。将上述得分相乘，若结果为0 分则为阴性，1～4 分为弱阳性，5～8 分为中阳性，9～12 分则为强阳性。

1.4 临床病理特征分析 统计所有患者的性别、年龄、分化程度、病理类型、临床分期及有无淋巴结转移等。1.5 观察指标 分析患者甲状腺癌组织与配对癌旁组织中Akt、CCND1 通路相关蛋白表达水平，分析上述指标与临床病理特征的相关性。

1.6 统计学方法 采用SPSS23.0 软件处理数据。计量资料以（±s）表示，行t检验；计数资料以%表示，采用χ2检验；多因素分析采用Logistic 回归分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Akt、CCND1 通路相关蛋白表达情况 甲状腺癌组织中Akt、CCND1 通路相关蛋白阳性表达率明显比甲状腺癌旁组织高（P＜0.05）。见表1。

表1 甲状腺癌组织及癌旁组织中Akt、CCND1 通路相关蛋白表达情况对比[例（%）]

2.2 Akt、CCND1 通路相关蛋白表达与临床病理特征单因素分析 Akt、CCND1 通路相关蛋白阳性表达与性别、年龄无关（P＞0.05），但可能与分化程度、病理类型、临床分期、淋巴结转移有关（P＜0.05）。见表2。

表2 Akt、CCND1 通路相关蛋白表达与临床病理特征的单因素分析[例（%）]

2.3 Akt、CCND1 通路相关蛋白表达与临床病理特征多因素分析 多因素Logistic 回归分析结果显示，甲状腺癌组织Akt、CCND1 通路相关蛋白表达阳性率高表达与甲状腺癌低分化、髓样癌、Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移存在密切相关性（OR＞1，P＜0.05）。见表3 至表5。

表3 赋值表

表4 Akt 通路相关蛋白表达与临床病理特征的多因素分析

表5 CCND1 通路相关蛋白表达与临床病理特征的多因素分析

3 讨论

甲状腺癌是我国发病率增长速度较快的恶性肿瘤之一，随着肿瘤的不断增长，可能压迫或侵犯邻近器官或组织，导致患者出现呼吸困难、吞咽困难等临床症状，严重影响患者的正常生活质量及生命安全。临床有研究表明，Akt、CCND1 通路异常表达与细胞的增殖与凋亡等诸多生物学行为密切相关，可能参与肿瘤的发生发展[7～8]。因此，分析Akt、CCND1 蛋白通路与甲状腺癌患者临床病理特征的相关性具有重要意义。

Akt 为组织蛋白激酶B，其在磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）下游被激活，也是细胞存活与增殖的关键调控因子，可经磷酸化多种底物发挥重要作用[9]。CCND1 属于高度保守的细胞周期蛋白家族，其成员在整个细胞周期内具有显著的蛋白质丰度周期性，可调节细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）。同时，该细胞周期蛋白与CDK4 或CDK6 形成的复合物能够对亚单位起发挥调节作用[10]。有研究表明，CCND1 蛋白与肿瘤抑制蛋白Rb 相互作用，该基因在发生突变、扩增与过表达时可能会改变细胞周期的进程，且利于肿瘤的发生[11]。本研究结果显示，甲状腺癌组织中Akt、CCND1 通路相关蛋白阳性表达率明显比甲状腺癌旁组织高，提示甲状腺癌组织中Akt、CCND1 通路相关蛋白阳性过表达。分析原因可能是，Akt 在与细胞膜上的磷脂酰肌醇相结合后可在细胞膜上聚集，经活化后形成p-Akt 进入细胞质与细胞核内，可作用于Akt 下游基因。p-Akt 可发挥抑制细胞凋亡相关蛋白与信号通路的作用，且能够阻滞细胞凋亡，并促进细胞的存活，再经下游分子缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）诱导血管内皮生长因子（VEGF）的表达，从而促进肿瘤血管的形成[12]。裴小娟等[13]采用组织芯片免疫组织化学SP 法检测p-Akt、c-Myc、E-cad 及VEGF 在甲状腺癌中的临床表达，分析其病理意义，发现p-Akt 的阳性高表达可能参与甲状腺癌的发生，且与调控肿瘤新生血管有关，这与本研究结果近似。

本研究进一步行Logistic 回归分析，结果显示低分化甲状腺癌组织Akt、CCND1 通路相关蛋白表达阳性率较中/ 高分化高，髓样癌甲状腺癌Akt、CCND1 通路相关蛋白表达阳性率较滤泡癌及乳头状癌高，Ⅲ～Ⅳ期甲状腺癌Akt、CCND1 通路相关蛋白表达阳性率较Ⅰ～Ⅱ期高，有淋巴结转移甲状腺癌组织Akt、CCND1 通路相关蛋白表达阳性率较无淋巴结转移高，提示Akt、CCND1 通路相关蛋白在甲状腺癌组织中的阳性表达与分化程度、病理类型、临床分期、淋巴结转移等具有一定关系。分析原因，Akt、CCND1 通路相关蛋白在特殊的环境或疾病影响下被激活，导致细胞的增殖、侵袭与迁移能力加强，可提高甲状腺癌的发生率，且增加肿瘤的恶性程度，加快病情进展。前者可通过调节细胞的增殖、凋亡等参与甲状腺癌的发生与发展；后者可促进细胞的增殖，并能够通过激活G1期特有蛋白CDK4 致使细胞周期异常，促成肿瘤细胞增殖等[14～15]。陈志峰等[16]通过对86 例甲状腺癌患者癌组织与癌旁组织中Akt/CCND1 通路相关蛋白表达的检测，发现甲状腺癌患者癌组织Akt、CCND1 蛋白阳性表达率高于癌旁组织，且与临床病理特征（分期、分化程度、病理分型及淋巴结转移）密切相关，这与本研究结果一致。

综上所述，Akt、CCND1 通路相关蛋白在甲状腺癌组织中的阳性表达率较癌旁组织高，且与临床病理特征（分化程度、病理类型、临床分期、淋巴结转移等）有一定关系。