那如三味片防治类风湿性关节炎的有效成分预测与靶点通路分析

杜晓鹂，金义辉，朱彦，苏佳，李刚*

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010059；2.天津中医药大学，天津 301617；3.内蒙古国际蒙医医院呼吸与危重症医学科，内蒙古 呼和浩特 010013）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一类以慢性关节滑膜炎和骨损伤为主要特点的慢性炎症性自体免疫病变，可导致严重残疾[1]。其一般侵害周围重要关节，并造成重要关节结构的破坏、畸形和功能损害。主要特征表现为手、脚小关节的发炎，并往往伴随着重要人体关节外器官损伤或血清类风湿因子阳性，同时也可伴随体质量的骤降、低热量和疲倦感等身体表现。更多的证据指出，RA患者会面临更多的并发症的风险，包括感染、恶性肿瘤和急性冠状动脉综合征[2～4]。目前还不完全了解这种疾病发生的机制。有研究提出，不同的环境因素，如吸烟、职业和大气因素可触发刺激易感个体基因的RA 的发展，导致滑膜增生和骨骼破坏。RA 的最初发病阶段与先天和适应性免疫的变化密切相关，随后形成了自身抗体，主要针对不同分子，也包括经过修改后的自我表位。在发病的以下阶段，先天的（如树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞）和适应性免疫细胞（如B 淋巴细胞和T 淋巴细胞）都有助于慢性炎症状态的扩增和持续。对RA发病机理中的重要细胞结构、介质和机制的认识，为开发新型精确的疾病修饰抗风湿药物提供了基础[5]。

目前治疗类风湿性关节炎药物主要包括疾病修饰剂（DMARDs），如磺胺嘧啶和甲氨蝶呤，以及最近使用的“生物制剂”，如抗TNF-α 药物[6]。现阶段人们广泛采用中西医结合方式来治疗和控制类风湿性关节炎的进展。那如三味（NRSW）片是中国传统蒙药，具消“黏”、除“协日乌素”、祛风、镇痛、散寒功效。其主要适用于风湿、关节酸痛、腰腿冷疼、牙痛、白喉等病症。其由制草乌、荜茇、制诃子组成，该三味药均为中、蒙医使用的传统植物药。方中草乌杀黏、止痛、燥黄水为主；诃子调理体素为辅；荜茇补胃火、祛巴达干赫依为之佐使。三药联用，对寒性黄水病、皮肤虫病、白喉、炭疽等“黏”病均有功效[7，8]。然而，由于蒙药基础研究的起步相对较晚，对其物质基础和作用机理仍缺乏深入的研究[9]。

网络药理学为新型科学，融合并运用了网络系统生理学、多向药理学、计算生理学、网络系统分析方法等多学科专业的研究手段与教学内容，以实现立体化网络系统的建构，从系统整合的视角去探讨医药与病理之间的联系，其整体性、系统性的特点，与传统中医药对处理疾病的总体观点和辨证论治基本原则相吻合。

1 资料与方法

1.1 那如三味片的化学成分数据库构建

利用TCMSP（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），Version 2.0[10]并结合BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/ index. php/）[11]数据库，搜集“草乌”“荜茇”“诃子”主要化学成分。

1.2 活性物质筛选

本课题以口服给药的生物利用度（oral bioavailability，OB）阈值OB≥30%和类药性（druglikeness，DL）阈值DL≥0.18 为主要活性物质的检测要求[12]，将TCMSP 中有较高活性的物质加以检测，增加数据分析处理的价值。BATMAN-TCM 数据库中通过设置Score cutoff to 20 及Adjusted P_value cutoff to 0.05相关参数进行活性化合物的筛选提取。

1.3 活性成分-作用靶点数据库构建

利用TCMSP检索活性成分靶点，整理收集到靶点导入Uniprot（https://www.uniprot.org/uniprot/）以及Inparanoid8（http://inparanoid.sbc.su.se/cgi-bin/index.cgi）数据库，将所有靶基因名称校正为其官方名称，剔除没有靶点的活性成分。

1.4 类风湿性关节炎疾病数据库构建

在PALM-IST 数据库（http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm/palmist_server.html）和COREMINE 数据库（https://www.coremine.com/medical/）中搜索关键词“rheumatoid arthritis”收集疾病相关靶点，整理后建立类风湿性关节炎相关靶点数据集。利用活性成分靶点与类风湿性关节炎靶点之间的匹配，得到那如三味片治疗类风湿性关节炎的潜在靶点，从而构建潜在靶点数据集。

1.5 那如三味片治疗类风湿性关节炎网络构建

利用IPA（ingenuity pathway analysis）应用程序，通过输入那如三味片活性成分的靶点建立药物和疾病互作网络图。

1.6 疾病、功能和通路分析

通过IPA 技术对那如三味片治疗类风湿性关节炎潜在靶点进行核心分析，以获取与其相关疾病、功能和通路等的有关信息，分析预测那如三味片治疗类风湿性关节炎的可能作用机制。

1.7 分子对接验证

从小分子数据库zink（https://zinc.docking.org/）下载小分子文件，从RCSB PDB（https://www.rcsb.org）下载大分子蛋白，通过Autodock 软件对小分子和蛋白进行处理、对接，计算结合能。

2 结果

2.1 那如三味片活性化合物筛选

通过TCMSP 和BATMAN-TCM 数据库共收集到那如三味片化合物172 种，其中草乌含27 种、荜茇含104种、诃子含41种。以OB≥30%、DL≥0.18及Score cutoff to 20、Adjusted P_value cutoff to 0.05 作为筛选条件，筛选出生物活性物质共33 种，其中草乌含10种、荜茇含15种、诃子含8种。

2.2 那如三味片活性化合物-作用靶点数据库构建

应用TCMSP 和BATMAN-TCM 分析平台，得到那如三味片各活性化合物的靶点信息，经去重后得到172个靶点。

2.3 疾病数据库构建

在PALM-IST 和COREMINE 数据库搜索关键词“rheumatoid arthritis”，共获取6 450个类风湿性关节炎相关靶点。将那如三味片活性成分靶点和类风湿性关节炎靶点匹配后，得到124 个那如三味片治疗类风湿性关节炎潜在靶点。

2.4 那如三味片治疗类风湿性关节炎网络的构建

将那如三味片活性成分靶点通过IPA应用程序录入数据库，建立“New My Pathway”，通过“Diseases and Functions”搜索“Rheumatoid arthritis”将其加入同一个“New My Pathway”，利用“Tool-Path Explorer”功能分别构建那如三味片及草乌、诃子、荜茇治疗类风湿性关节炎网络图，详见图1、图2（A、B、C）。通过IPA 网络分析预测出47 个那如三味片治疗类风湿性关节炎的作用靶点，主要包括细胞/增长因子：CXCL8、TNF、TNFSF11、IL6、IL10、IL1B、VEGFA；G蛋白偶联受体：ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRB2、OPRD1、DRD2、OPRM1、HTR2A、ICAM1；转运体：SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、ABCB1；代谢酶：MAOA、MAOB、CYP1A2、CYP2B6、DPAGT1、PTGS2、CA2、ACLY、PTGS1、XIAP、ACHE；离子通道：KCNJ15、GABRA1；激酶：LRRK2、CCNB1；核受体：PGR；肽酶：MMP9、MMP2、IGHG1、F10、CASP3；转录调节：NFKBIA、NCOA2、FOS、TP53 等。那如三味片各成分中，发挥治疗类风湿性关节炎的有效成分主要有草乌中的脱氧乌头碱（Deoxyaconitine）、乌头碱（Aconitine）、中乌头碱（Mesaconitine）、次乌头碱（Hypaconitine）、惰碱（Ignavine）等；荜茇中的荜茇壬三烯哌啶（Dehydropipernonaline）、胡椒碱（Piperine）、荜茇明宁碱（Piperlonguminine）等；诃子中的碎叶紫堇碱（Cheilanthifoline）、霹雳萝芙辛碱（Peraksine）等。由表1 可知，那如三味片中不同活性成分可作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，体现其多成分、多靶点的协同作用。其中草乌活性成分主要作用靶点为多巴胺转运体（SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4），它们是哺乳动物SLC6（溶质载体6）家族中的成员，所有SLC6 转运体均为Na+/Cl-依赖的质膜转运体，根据SLC6 转运体进化关系可以进一步划分为4 个亚科，单胺转运体即去甲肾上腺素的转运体（SLC6A2）、多巴胺（SLC6A3）、血清素即5-羟色胺（血管收缩素）（SLC6A4），此3种同属于一个亚科[13]。

图1 那如三味片治疗类风湿性关节炎网络图

图2 药物中各成分治疗类风湿性关节炎网络图A.草乌治疗RA网络图；B.诃子治疗RA网络图；C.荜茇治疗RA网络图

2.5 疾病、功能及通路分析

那如三味片活性成分靶点和类风湿性关节炎靶点匹配后，得到124 个那如三味片治疗类风湿性关节炎潜在靶点。通过IPA 可以对这些潜在靶点进行核心解析，得到这些生物分子所涉及的主要疾病包括神经性疾病、组织损伤和畸形、心理障碍、炎症疾病、免疫调节失常等（见图3）。主要通路包括5-羟色胺受体信号、G蛋白偶联受体信号、磷酸腺苷活化蛋白激酶信号等（见图4）。这提示了类风湿性关节炎病情的发生发展进程与5-羟色胺受体的结合活性、炎症、免疫调节等密切相关。其中ADRB2、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、MAOA、PTGS1、PTGS2、SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4、IL6、IL10、IL1B、TNF 等基因在类风湿性关节炎疾病发生发展中可能有重大影响，如参与腺苷酸环化酶抑制的G 蛋白偶联受体信号通路、腺苷酸环化酶抑制5-羟色胺受体信号通路、骨重塑、5-羟色胺受体代谢等生物过程，各通路对应的作用靶点见表2。

表2 各通路权重及对应作用靶点

图4 生物分子蛋白通路排序

2.6 那如三味片对类风湿性关节炎作用靶点分子对接结果分析

分子对接展示图（见图2）展示了配体与蛋白分子间的相互作用。分子对接结果（见表3、图5）显示那如三味片与多个靶点形成氢键作用，结合能≤-1.2 Kcal/mol，构象能量低，结构稳定，具有较好活性。

表3 碎叶紫堇碱(Cheilanthifoline)、玫瑰树碱（Ellipticine）胡椒碱(Piperine)与ADRB2、PTGS2、SLC6A4的分子对接

图5 那如三味片对类风湿性关节炎作用靶点分子对接展示图

3 讨论

类风湿性关节炎（RA）是一类慢性炎症病变，滑膜炎为其主要的病变特点。白细胞浸润和滑膜细菌的活化，导致了软骨和骨的损伤。而日益增多的研究资料也证实了致炎细胞因子造成的发炎、细菌繁殖和激活在RA 的发生机理上起到了关键性作用。本文通过网络药理学方法分析探讨了蒙药那如三味片治疗类风湿性关节炎的主要活性成分、作用靶点及通路。这些作用靶点主要包括单胺氧化酶A基因（MAOA）、肾上腺素能受体基因（ADRA1D、ADRA2B）、多巴胺转运体基因（SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4）、细胞/增长因子（IL6、IL10、TNF）等；通路主要包括5-羟色胺受体信号、G 蛋白偶联受体信号、磷酸腺苷活化蛋白激酶信号等。

血清素（5-羟色胺）是一种神经递质，在脑内平衡中起着重要作用。最新的研究表明，血液中的5-羟色胺是成骨细胞生成的调节因子，可以抑制骨形成[14]。因此，测量血清中5-羟色胺水平对诊断RA具有一定的临床意义。本文对那如三味片治疗类风湿性关节炎进行系统网络药理学分析得出主要通路包括5-羟色胺受体信号，在文献中得到证实。

G 蛋白偶联受体（GPCRs）是一种跨膜受体蛋白，是膜蛋白中最大的家族，有人类基因组中的800多个基因编码。GPCRs 包含7 个跨膜螺旋束，为配体提供结合位点[15]。GPCRs中含有许多特异性免疫受体，如β2-肾上腺素能受体（β2-AR）、前列腺素E2（PGE2）受体、趋化因子受体、腺苷受体等。这些受体通过介导细胞外刺激（包括光、蛋白质、肽、小分子、激素、质子和离子）的信号转导，积极参与细胞的病理和生理过程[16]。GPCRs信号通路在炎症和免疫反应过程中发挥重要作用，包括类风湿性关节炎[17]。本文经系统网络药理学分析得出那如三味片治疗类风湿性关节炎主要通路包括G 蛋白偶联受体信号，与文献中的报道一致[14]。

网络药理学分析结论提示草乌的主要活性成分脱氧乌头碱（Deoxyaconitine）、乌头碱（Aconitine）、中乌头碱（Mesaconitine）、次乌头碱（Hypaconitine）、惰碱（Ignavine）、北乌头碱（Beiwutine）、异乌头碱（Isoaconitine）和紫草乌碱（Delavaconitine）主要参与了5-羟色胺受体信号通路（HTR1B、HTR3A、SLC6A4、MAOA）和多巴胺受体信号通路（SLC6A3、MAOA）。SLC 类可溶性载体成为细菌膜上的主要信号传导者，是药物进出细胞的关键，在体内药物的处置过程、有效性以及不良反应等方面起至关重要的作用[18]。治疗类风湿性关节炎的药物多为转运体底物，如柳氮磺胺吡啶和甲氨蝶呤等。了解类风湿关节炎下转运体的变化对于药代学、药效学研究和指导临床用药至关重要[19]。值得注意的是，草乌对肾脏的毒性主要通过SCN10A和SCN5A离子通道作用于3 个G 蛋白偶联受体靶点（ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C），对心脏毒性主要作用于HSP90AB1 靶点。这些靶点全部来自于草乌中的惰碱（Ignavine）。草乌成分相当复杂。研究已证实其有毒成分主要依赖双脂型乌头酸的水解及分解程度，动物试验证实生草乌水煎剂在约2 h 时毒害程度最高，约4 h 时毒害程度则明显降低。动物中毒试验研究亦表明，生草乌潜在具有人体心血管循环网络系统、神经、肾、胚胎、生殖毒性作用等，因此妊娠期应禁用。乌头碱中毒目前还缺乏特效的解毒品，防治的关键是适时、合理地纠正慢性心律失常，保持生命体征稳定，并同时给予洗胃、静脉注射补液等处理措施。本文采用了网络药理学、分子对接的分析方法，得出了草乌肾毒与心脏中毒反应有关的主要活性成份和靶点，为进一步确定其中毒反应的化学物质基础、中毒反应机理，以及与炮制药剂配伍的经济增效减脂机理，提供了依据[20]。惰碱是否对肾脏和心脏产生毒性及如何在炮制、提取等工艺中对草乌进行减毒、去毒从而使那如三味片更加有效、安全地发挥治疗类风湿性关节炎的作用，有待后续进一步研究。综上所述，那如三味片网络药理学研发平台的形成，不但对明确该蒙药治疗类风湿性关节炎的物质基础和作用机制及临床作用特点、指导临床定位和合理用药具有重要意义，而且也为建立质控指标体系、设计与优化蒙药产品制备工艺流程等提供了依据。