三七总皂苷对华法林抗凝作用的影响及机理研究

胡少男，赵 博，李鹏跃，冯舒娅，武慧蓉，杜守颖*

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010059；2.北京中医药大学中药学院，北京 100029）

华法林是临床一线口服抗凝药物，广泛用于预防心房颤动、心脏瓣膜置换等引发的血栓栓塞及脑卒中事件，以及预防和治疗深静脉血栓和肺栓塞[1]。华法林的循证医学证据充足、价格低廉，因此成为抗凝治疗的首选药物之一。然而，华法林的临床应用也有许多局限性，包括治疗窗狭窄、需要频繁的临床监测等[2]。华法林在临床使用时易受多种食物和药物的影响，包括中药和西药。其可导致华法林抗凝强度的增强或减弱，甚至发生严重不良反应。根据2005年的系统性回顾研究，可影响华法林抗凝作用的药物和食物多达120 余种，且数量还在不断扩增[3]。众所周知，中药在我国的临床应用十分普遍，同时在全球范围内作为补品或替代药物的使用情况也逐年增多[4]。中药在心脑血管疾病的治疗方面具有独特的优势，在临床应用时与华法林联用的机会较多。

三七总皂苷是从三七根部提取的有效成分，具有活血祛瘀、通脉活络之功效。主要用于治疗中风偏瘫、瘀血阻络证。研究表明，一定剂量的三七水煎液可显著延长华法林在大鼠体内的代谢时间[5]。三七总皂苷还具有抑制血小板聚集和抗凝功效，可能会与华法林发挥协同抗凝作用[6]。临床研究表明，血塞通注射液（主成分为三七总皂苷）联合华法林可更好地降低非大面积急性肺栓塞患者的肺动脉压，并能缩短治疗时间，疗效优于常规的华法林抗凝治疗[7]。此外，有学者初步探究了三七总皂苷对华法林抗凝作用的影响，但对凝血功能的评价仅局限于PT[8]。因此，本文通过凝血四项全面评价三七总皂苷对华法林抗凝作用的影响，并以凝血因子和华法林代谢酶阐释相关机理。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器

三七总皂苷（云南三七科技有限公司，批号：180301）；华法林钠片（芬兰奥利安大药厂，批号：1821813）；SPF 级SD 大鼠（雄性，体质量160～180 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0006）；PT、APTT、FIB、TT 测定试剂盒（凝固法，北京赛科希德科技股份有限公司）；纤维蛋白原参比血浆、定标血浆（美国太平洋公司，货号：100602、100301）；乏Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子血浆试剂盒（美国Instrumentation Laboratory 公司，货号：0020012200、0020011700、0020011900、0020010000）；TIANScript cDNA第一链合成试剂盒（天根生化科技有限公司，货号：KR104）；Trans Start Green qPCR SuperMix 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，货号：AQ101）；CYP 2C11、CYP 1A2和CYP 3A4抗体（美国Abcam公司，货号：ab3571、ab22717和ab3572）；全自动凝血测试仪（北京赛科希德科技股份有限公司）；凝血检测仪（罗氏诊断有限公司，德国）；超微量紫外/可见分光光度计（Thermo 公司，美国）；荧光定量PCR 仪（杭州博日科技有限公司）；垂直电泳槽（ATTO公司，日本）；电泳仪（北京六一仪器厂）；转移电泳槽（上海天能科技有限公司）；凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与处理 将120 只大鼠按随机数表法分为3 大组，每大组40 只。然后再将各大组均随机分为4 小组，即对照组（Control）、三七总皂苷组（PNS）、华法林组（Warfarin）、联用组（PNS-Warf），每小组10只。根据临床单日等效剂量折算，三七组和联用组灌胃三七总皂苷31.25 mg/kg，1 次/d，连续14 d，而对照组和华法林组灌胃等体积蒸馏水。随后，各大组中的华法林组和联用组在前述14 d 灌胃的最后5 d，同时灌胃华法林钠（0.5%CMC-Na 溶液混悬），1 次/d，而对照组和三七组同时灌胃等体积0.5%CMC-Na 溶液。此外，各大组中的华法林组和联用组，华法林的使用剂量分别为低剂量、中剂量、高剂量（0.3 mg/kg、0.4 mg/kg和0.5 mg/kg）。

1.2.2 凝血四项和凝血因子活性检测 大鼠腹主动脉取血并制备血浆，根据PT、APTT、TT 和FIB 检测试剂盒说明书操作步骤，测定凝血四项值，并根据PT 值计算INR 值。利用各乏因子血浆测定中剂量华法林各组大鼠血浆凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的活性，根据试剂盒说明书进行操作，并计算相应凝血因子的活性百分比。

1.2.3 RT-qPCR 分析 提取中剂量华法林各组大鼠肝组织总RNA，按照TIANScript cDNA 第一链合成试剂盒说明书将各组总RNA进行反转录，以合成对应的第一链cDNA。将各样品cDNA 稀释10 倍后取2 μL作为模板，分别用目标基因引物和内参基因引物进行扩增（见表1）。以β-Actin作为内参，利用2-CT法计算各组目标基因相对表达水平。

表1 RT-qPCR引物信息

1.2.4 Western Blot 分析 通过RIPA 裂解液（含PMSF）提取中剂量华法林各组大鼠肝组织总蛋白。用6%～12% SDS-PAGE 分离总蛋白，湿法转至PVDF 膜。将PVDF 膜置于5%脱脂奶粉，室温封闭30 min。洗涤后加一抗，室温孵育2 h。充分洗涤后加二抗，室温孵育1 h。充分洗涤，ECL显影液显影，凝胶成像系统拍照。使用Image J 软件分析蛋白的相对表达量。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件计算并进行统计学分析，计量数据均表示为平均值±标准差（±s），采用ANOVA 方差分析进行组间差异性比较；计数数据用[n（%）]描述，利用χ2检验。检验水准为α=0.05，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对华法林抗凝作用的影响

2.1.1 凝血酶原时间（PT） 如表2所示，三七总皂苷组的PT较对照组间差异无统计学意义（P＞0.05），而低、中、高剂量华法林组的PT较对照组剂量依赖性延长，且组间差异有统计学意义（P＜0.05）；三七总皂苷与各剂量华法林联用后，PT较单用华法林均不同程度延长，且组间差异有统计学意义（P＜0.05）。这表明联用三七总皂苷可增强不同剂量华法林对PT的影响。

表2 三七总皂苷对华法林抗凝作用—PT的影响（±s，s）

表2 三七总皂苷对华法林抗凝作用—PT的影响（±s，s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与华法林组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

组别凝血酶原时间（秒）低剂量华法林中剂量华法林高剂量华法林对照组三七总皂苷组华法林组联用组11.03±0.33 11.22±0.39 18.80±8.58*32.02±12.39**△11.76±0.34 11.62±0.36 31.71±11.41**55.03±14.53**△△11.52±0.54 11.45±0.26 47.29±18.95**80.00±24.97**△△

2.1.2 活化部分凝血活酶时间（APTT） 如表3 所示，三七总皂苷组的APTT 较对照组差异无统计学意义（P＞0.05），而低、中、高剂量华法林组的APTT较对照组剂量依赖性延长，其中，中、高剂量华法林组较对照组差异有统计学意义（P＜0.05）；三七总皂苷与各剂量华法林联用后，APTT 较单用华法林均不同程度延长，且组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。这表明联用三七总皂苷可增强不同剂量华法林对APTT的影响。

表3 三七总皂苷对华法林抗凝作用—APTT的影响（±s，s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与华法林组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

组别活化部分凝血活酶时间（秒）低剂量华法林中剂量华法林高剂量华法林对照组三七总皂苷组华法林组联用组17.48±0.59 17.08±0.45 19.40±6.76 28.73±11.37*△17.71±0.48 17.56±1.02 28.62±11.20**43.23±10.53**△△17.43±1.05 17.23±0.93 42.43±18.39**63.25±20.04**△

2.1.3 凝血酶时间（TT）如表4 所示，三七总皂苷组、华法林组及联用组的TT 较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。这表明三七总皂苷和华法林在单用或联用时对TT均无显著影响。

表4 三七总皂苷对华法林抗凝作用—TT的影响（±s，s）

表4 三七总皂苷对华法林抗凝作用—TT的影响（±s，s）

组别凝血酶时间（秒）低剂量华法林中剂量华法林高剂量华法林对照组三七总皂苷组华法林组联用组33.63±1.50 34.72±2.31 32.88±1.15 33.05±1.60 33.88±1.20 35.08±2.93 33.35±1.81 34.60±1.98 34.88±1.64 36.45±0.91 34.04±0.96 35.25±1.80

2.1.4 纤维蛋白原（FIB）含量 如表5所示，华法林组的FIB含量较对照组差异无统计学意义（P＞0.05），而三七总皂苷组与联用组的FIB含量较对照组均显著降低，且组间差异无统计学意义（P＞0.05）。这表明三七总皂苷可降低大鼠血浆纤维蛋白原含量，而不同剂量华法林对纤维蛋白原含量并无显著影响。

表5 三七总皂苷对华法林抗凝作用—FIB含量的影响（±s，s）

表5 三七总皂苷对华法林抗凝作用—FIB含量的影响（±s，s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与华法林组比较，△P ＜0.05。

组别纤维蛋白原含量（g/L）低剂量华法林中剂量华法林高剂量华法林对照组三七总皂苷组华法林组联用组2.59±0.20 2.32±0.14*2.63±0.33 2.34±0.13*△2.54±0.11 2.29±0.27*2.58±0.18 2.27±0.30*△2.58±0.12 2.33±0.20*2.48±0.17 2.22±0.27**△

2.2 对华法林作用凝血因子的影响

2.2.1 凝血因子活性 如表6所示，三七总皂苷组凝血因子活性较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；华法林组凝血因子活性较对照组均不同程度降低，其中凝血因子Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ组间差异有统计学意义（P＜0.05）；联用组凝血因子活性较华法林组均不同程度降低，其中凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅹ组间差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究表明，三七总皂苷可增强华法林对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ活性的抑制作用，而其本身对上述凝血因子活性无显著影响。

表6 三七总皂苷对华法林作用凝血因子活性的影响（±s）

表6 三七总皂苷对华法林作用凝血因子活性的影响（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与华法林组比较，△P ＜0.05。

Group Factor ⅡFactor ⅦFactor ⅨFactor ⅩControl PNS Warfarin PNS-Warf 81.4±16.9 83.5±19.6 63.9±22.8 36.0±25.4△**103.6±13.2 100.7±21.8 73.0±33.2*39.8±23.3△**92.4±18.4 97.7±23.0 67.3±31.5*43.3±28.6**118.8±19.2 110.8±29.3 50.8±35.1**25.3±14.6△**

2.2.2 凝血因子基因表达 如图1所示，三七组凝血因子基因表达较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；华法林组凝血因子基因表达较对照组差异有统计学意义（P＜0.05）；联用组凝血因子基因表达较华法林组均不同程度降低，其中凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ组间差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究表明，三七总皂苷可增强华法林对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ基因表达的抑制作用，而其本身对上述凝血因子的基因表达无显著影响。

图1 三七总皂苷对华法林作用凝血因子Ⅱ（A）、Ⅶ（B）、Ⅸ（C）、Ⅹ（D）基因表达的影响N.S.表示差异无统计学意义；与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与华法林组比较，△P ＜0.05。

2.3 对大鼠肝脏华法林代谢酶的影响

如图2 所示，华法林组CYP1A2、CYP2C11 和CYP3A4蛋白表达较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；三七总皂苷组与联用组CYP1A2蛋白表达较对照组显著升高，而CYP2C11 和CYP3A4 较对照组显著降低，且两组间各蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究表明，三七总皂苷可诱导CYP1A2表达，抑制CYP2C11 和CYP3A4 表达，而华法林对各代谢酶表达无显著影响。

图2 三七总皂苷对大鼠肝脏华法林代谢酶CYP1A2（A）、CYP2C11（B）和CYP3A4（C）蛋白表达的影响N.S.表示差异无统计学意义；与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与华法林组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

3 讨论

华法林作为临床一线口服抗凝药物，广泛应用于预防和治疗血栓栓塞性疾病。华法林是通过抑制凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的肝脏合成而发挥抗凝作用[9]。目前，临床主要以“凝血四项”反映机体止血与凝血系统的状况，包括APTT、PT、FIB 和TT[10]。其中，APTT（延长）主要用于筛查凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ等的缺乏，PT（延长）主要用于筛查凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ等的缺乏，FIB主要反映血浆纤维蛋白原的含量，而TT 主要反映纤维蛋白原转为纤维蛋白的时间[11]。此外，INR 值作为华法林抗凝监测的首选指标，是由PT 演算而来。应用华法林抗凝治疗，一般要求INR值维持在2.0～3.0的合理范围[12]。

中药在心脑血管疾病的治疗方面具有独特的优势，在临床应用时与华法林联用的机会较多。一项Meta 分析研究了9 项中药与华法林联用的临床试验，表明中药联合华法林对房颤患者血栓栓塞的预防优于单用华法林，并且不会增加患者出血风险[13]。中药成分复杂，对华法林抗凝作用的影响也极其复杂。近年来，中药与华法林发生相互作用而引起INR 水平变化或不良反应的报道屡见不鲜。有学者初步探究了三七总皂苷对华法林抗凝作用的影响，但对凝血功能的评价仅局限于PT[8]。因此，本文以凝血四项全面评价三七总皂苷对华法林抗凝作用的影响，并以凝血因子和华法林代谢酶阐释相关机理。

在本研究中，低剂量华法林单用及与三七总皂苷联用的INR值（由PT值演算）分别为（1.71±0.78）和（2.89±1.11），中剂量华法林单用及与三七总皂苷联用的INR值分别为（2.83±1.03）和（4.90±1.30），高剂量华法林单用及与三七总皂苷联用的INR 值分别为（4.27 ± 1.71）和（7.21 ± 2.26）。这表明三七总皂苷与各剂量华法林联用均可发挥协同抗凝作用。其中，中剂量华法林单用和三七总皂苷-低剂量华法林联用等效、合理抗凝。这提示降低华法林用量并联用三七总皂苷可以保证合理的抗凝效果，降低血栓栓塞风险。此外，纤维蛋白原（FIB）作为血栓形成的原料，其血浆含量是溶栓治疗的一级检测指标[11]。在本研究中，三七总皂苷单用及与各剂量华法林联用的FIB 含量较对照组均显著降低，且二者差异无统计学意义，表明联用三七总皂苷还可能通过减少FIB含量而降低血栓栓塞风险。

临床应用的华法林是一种外消旋混合物，包括S-华法林和R-华法林两种异构体，其中S-华法林提供了60%～70%的抗凝活性[14]。S-华法林主要由人体肝脏代谢酶CYP2C9 代谢，而R-华法林则主要由CYP1A2 和CYP3A4 代谢[14]。华法林抗凝易受多种食物和药物影响，例如可通过诱导（或抑制）华法林的肝脏代谢酶而抑制（或增强）其抗凝作用[9]。为进一步从蛋白分子角度阐释三七总皂苷对华法林抗凝作用的影响机理，我们研究了三七总皂苷对华法林作用的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的活性和基因表达的影响，并研究了三七总皂苷对大鼠肝脏华法林代谢酶CYP2C11、CYP1A2 和CYP3A4 的蛋白表达的影响。其中，大鼠肝脏中CYP2C11与人体肝脏中S-华法林代谢酶CYP2C9 在氨基酸序列、代谢底物等方面具有77%的同源性[15，16]，并且CYP2C11 是雄性大鼠肝药酶中最丰富的特异性亚型，约占成年雄性大鼠肝药酶总量的50%[17]。对凝血因子的研究表明，尽管联用组凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的活性和基因表达较华法林组均不同程度降低，但单用三七总皂苷对上述凝血因子无显著影响，这与PT 和APTT 的研究结果一致。对华法林肝脏代谢酶的研究表明，三七总皂苷组和联用组R-华法林代谢酶CYP1A2 的蛋白表达较对照组显著增加，S-华法林代谢酶CYP2C11 和R-华法林代谢酶CYP3A4 的蛋白表达较对照组显著降低，而华法林对这三种代谢酶的蛋白表达无显著影响。有研究表明[18]，S-华法林的抗凝活性是R-华法林的3～5倍。因此，三七总皂苷可能是通过抑制大鼠肝药酶CYP2C11 和CYP3A4 的表达降低华法林在大鼠体内的代谢，从而使华法林作用的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的活性和基因表达较单用华法林进一步降低，发挥协同抗凝作用。

综上所述，本文研究了三七总皂苷对华法林抗凝作用的影响及相关机理。三七总皂苷可能通过抑制大鼠肝脏S-华法林代谢酶CYP2C11和R-华法林代谢酶CYP3A4的表达而降低华法林在大鼠体内的代谢，进而增强华法林对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的抑制作用，使二者发挥协同抗凝作用。而三七总皂苷对上述凝血因子并无调控作用，但可通过减少FIB含量协同降低血栓栓塞风险。因此，在华法林临床应用过程中，若与三七总皂苷联用，可通过调整华法林用量以保证合理的抗凝效果，降低血栓栓塞风险，避免因两药联用造成抗凝过度而增加出血风险。