红萝卜中芥子苷酶提取工艺的研究

胡燕 李英娜 刘莹莹 胡舰 王荣兰 朱云龙 何志贵

摘要：该研究以红萝卜为原料，用硫酸铵沉淀法提取芥子苷酶，使用考马斯亮蓝法和双缩脲法对粗提物进行了蛋白质定性分析。以提取率为指标，考察液料比、浸提时间、缓冲溶液pH 3个因素对提取率的影响，根据单因素实验结果，进行正交实验，得到最佳提取条件为液料比3（mL/g），浸提时间3 h，缓冲溶液pH 7.0。在此条件下，芥子苷酶粗提物提取率为5.74%，采用DNS法测定酶活，结果显示酶活为96 U。此研究结果能为红萝卜中芥子苷酶的后续研究提供实验基础，为红萝卜的开发和利用提供科学依据。

关键词：红萝卜；酶活；芥子苷酶；提取率

中图分类号：TS201.2      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）07-0128-05

Abstract： In this study， red radish is used as the raw material to extract myrosinase by ammonium sulfate precipitation method， and the protein in crude extract is qualitatively analyzed using Bradford method and biuret method. With extraction rate as the index， the effects of three factors including liquid-solid ratio， extraction time and pH of buffer solution on the extraction rate are investigated. According to the results of single factor experiment， orthogonal experiment is carried out. It is determined that the best extraction conditions are the liquid-solid ratio of 3 （mL/g）， the extraction time of 3 h and pH of the buffer solution of 7.0. Under such conditions， the extraction rate of crude extract of myrosinase is 5.74%. The enzyme activity is determined by DNS method. The results show that the enzyme activity is 96 U. The results can provide experimental basis for the follow-up study on myrosinase in red radish and scientific basis for the development and utilization of red radish.

Key words： red radish; enzyme activity; myrosinase; extraction rate

遍布全球的十字花科植物（Cruciferac）有著独特的生存和扩展优势，主要得益于它们特殊的芥子苷酶防御系统，该系统由一种次生代谢物硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷水解酶组成[1]，如茎用芥菜、萝卜、雪里蕻等。含硫代葡萄糖苷的植物总是携带能够水解硫代葡萄糖苷的芥子苷酶，硫代葡萄糖苷存在于液泡中，不与芥子苷酶直接接触。当植物的结构被破坏时，硫代葡萄糖苷被芥子苷酶水解，葡萄糖被释放[2]。因此，对芥子苷酶的研究具有重大意义。

目前对芥子苷酶的研究主要集中在对芥子苷酶的分离纯化和芥子苷酶的特性两个方面。赵大云等[3]对雪菜芥子苷酶的特性研究和徐伟丽等[4]对茎用芥菜芥子苷酶的特性研究皆表明，芥子苷酶会影响含硫甙蔬菜加工中风味和色泽。芥子苷酶对于腌制萝卜风味的形成有重要作用，同时腌制过程中萝卜会逐渐变黄甚至变褐[5]，何凤平等[6]研究发现萝卜腌制品中黄色素的形成与萝卜中芥子苷酶催化的硫甙的降解有关，可见芥子苷酶对腌制萝卜的质量产生重大影响，但目前未见对萝卜中芥子苷酶提取方法的研究。本实验用硫酸铵盐析法提取萝卜中芥子苷酶，通过考马斯亮蓝法和双缩脲法对酶粗提取物进行定性分析，再通过酶联检测法检测酶活性，有助于对芥子苷酶的后续研究，对于萝卜加工的研究具有支撑作用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 实验材料与试剂

红萝卜：购于哈尔滨市地利生鲜水果超市。

磷酸二氢钠、氢氧化钠、硫酸铵、聚乙二醇6000、丙酮、硫酸铜、考马斯亮蓝、3，5-二硝基水杨酸、苯酚、无水亚硫酸钠、Vc、偏磷酸、酒石酸钾钠、葡萄糖、盐酸、辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷：均为分析纯。

1.1.2 仪器设备

MB1002型多功能食品加工机 宁波美居电器有限公司；85-2A型恒温磁力搅拌器 天津市赛多利斯实验分析仪器制造厂；DHG-9175A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；UV-5200型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TG16-WS型台式高速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；PHS-3C型台式酸度计 上海雷磁仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芥子苷酶的提取

1.2.1.1 芥子苷酶提取方法

使用硫酸铵盐析法[7]，称取新鲜的萝卜样品，加磷酸缓冲液后于组织搅碎机上匀浆，在4 ℃下浸提，匀浆液用80目的纱布过滤，滤液以12 000 r/min离心20 min（4 ℃），取上清液缓慢地加入硫酸铵，使其饱和度达到67%，持续缓慢1 h后，以12 000 r/min离心20 min，取沉淀（粗酶提取物），用0.01 mol/L磷酸缓冲溶液溶解后透析，溶解后置于分子截留量为1 000的透析袋中对蒸馏水透析24 h，透析内液用PEG-6000浓缩至20 mL后，冷冻贮藏待用。

1.2.1.2 芥子苷酶提取率计算方法

芥子苷酶提取率的计算见下式：

R（%）=m 1-m 2m 3×100。

式中：R为芥子苷酶提取率（%）；m 1为离心筒与沉淀物质量总和（g）；m 2为离心筒的质量（g）；m 3为红萝卜的质量（g）。

1.2.2 芥子苷酶粗提取物定性分析

1.2.2.1 考马斯亮蓝法

取1 mL待测液加入5 mL考马斯亮蓝溶液于比色皿中，取1 mL磷酸缓冲溶液于比色皿中，加入5 mL考马斯亮蓝溶液，在595 nm处测定吸光度值。

1.2.2.2 双缩脲试剂显色法

配制A液（100 mL 0.1 g/mL NaOH溶液），B液（100 mL 0.01 g/mL硫酸铜溶液）。先吸取3 mL双缩脲试剂A加入3 mL组织样液，将其振荡均匀（需营造一个碱性环境），然后加1～2滴双缩脲试剂B，再次振荡均匀。如果组织中含有蛋白质，溶液就会变成紫色，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。

1.2.3 芥子苷酶提取率的单因素实验

1.2.3.1 液料比对芥子苷酶提取率的影响

取50 g红萝卜样品，分别加入50，100，150，200，250 mL pH值为7.0的磷酸缓冲液，于组织搅碎机上匀浆，4 ℃浸提3 h，匀浆液用80目纱布过滤，滤液以12 000 r/min离心20 min（4 ℃），取上清液缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到60%，持续缓慢1 h后，以12 000 r/min离心20 min，取沉淀（粗酶提取物）用0.01 mol/L磷酸缓冲溶液溶解后透析，溶解后置于分子截留量为1 000的透析袋中对蒸馏水透析24 h，透析内液用PEG-6000浓缩至20 mL后，冷冻贮藏待用。

1.2.3.2 浸提时间对芥子苷酶提取率的影响

取50 g红萝卜样品，分别加入150 mL pH值为7.0的磷酸缓冲溶液，于组织搅碎机上匀浆，4 ℃条件下分别浸提0.5，1，2，3，4，5 h，匀浆液用80目纱布过滤，后续操作同1.2.3.1。

1.2.3.3 缓冲溶液pH对芥子苷酶提取率的影响

取50 g红萝卜样品，分别加入150 mL pH值为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的磷酸缓冲溶液，于组织搅碎机上匀浆，4 ℃条件下浸提3 h，匀浆液用80目纱布过滤，后续操作同1.2.3.1。

1.2.4 芥子苷酶提取率的正交实验

为使提取率最高，在芥子苷酶提取率单因素实验的基础上，选取影响显著的3个因素的3个最佳水平，进一步进行正交实验，进而确定芥子苷酶提取率的最优条件。正交实验的3个因素为液料比、浸提时间、缓冲溶液pH，每个因素取3个水平，见表1。选用L 9（33）正交表进行实验，计算最终提取率，确定提取芥子苷酶最佳方案。

1.2.5 芥子苷酶提取正交实验最优条件的验证实验

在正交实验得出的最优条件下进行验证实验，平行测定3次，计算提取率。

1.2.6 芥子苷酶酶活的测定

芥子苷酶活力单位（U）定义：1 g酶粉在一定温度和pH条件下酶解反应1 h，释放出1 μmol葡萄糖为1个酶活力单位，以μmol葡萄糖/（g·h）表示。

精密称取粗酶粉0.02 g，加入0.4 mL浓度为0.04 mol/L的Vc，0.8 mL浓度为0.1 mol/L（pH 8.0）的磷酸缓冲液，随后将其置于50 ℃的水浴锅中保温5 min，添加0.5 mL浓度为3 mg/mL的辛基硫代葡萄糖苷，定容至3.5 mL。反应1 h，以0.2 mL 18%的偏磷酸终止反应。使用DNS法测定释放出的葡萄糖量。

1.2.6.1 配制葡萄糖标准溶液

准确称取分析纯葡萄糖100 mg，将其放置于小烧杯中，加入少量的蒸馏水溶解后，转移到100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.6.2 DNS试剂的配制

称取酒石酸钾钠182 g、3，5-二硝基水杨酸7 g，加热溶于500 mL水中，加入15 g NaOH，边加边搅拌，再加入4 g苯酚和1 g无水亚硫酸钠，溶解冷却后加入水定容到1 000 mL，静置7 d。

1.2.6.3 绘制葡萄糖标准曲线

按表2中方法混合均匀后，沸水浴5 min，冷却后加入4 mL蒸馏水，混匀，在540 nm下测OD值。

1.2.6.4 样品酶活的测定

取4支比色管，標号0，1，2，3，其中0号试管为对照，设置3组平行实验，分别加入酶解后的样品0，0.5，0.5，0.5 mL，再分别加入DNS试剂0.5 mL混匀，沸水浴5 min，冷却后加入4 mL蒸馏水混匀，测OD值。

2 结果与分析

2.1 芥子苷酶粗提物定性实验结果与分析

2.1.1 双缩脲法测定结果与分析

将芥子苷酶粗提取物用双缩脲法检测，结果显示，样液振荡均匀后由蓝色变为淡紫色，由此确定粗酶提取物中含有蛋白质。

2.1.2 考马斯亮蓝法测定结果与分析

将芥子苷酶粗提取物进行考马斯亮蓝法定性分析，在595 nm下测定吸光度值为2.234，吸光度值较高，由此可确定芥子苷酶粗提取物中蛋白质含量高。

2.2 芥子苷酶提取率的单因素实验

2.2.1 液料比对芥子苷酶提取率的影响

芥子苷酶提取过程中，在其他因素相同的条件下，考察液料比对芥子苷酶提取率的影响，见图1。

由图1可知，当液料比在1∶1～2∶1之间时，芥子苷酶提取率显著升高，从3.18%上升至5.48%；液料比在2∶1～3∶1之间时，提取率趋缓，从5.48%上升至5.56%，且当液料比为3∶1时，提取率出现峰值5.56%；液料比在3∶1～5∶1之间时，提取率稍有下降，从5.56%下降至5.33%。所以液料比在3∶1时，粗酶提取物已经被最大程度提取，再增加磷酸缓冲溶液，提取率也不会增高，并且会造成溶剂的浪费，增加成本损耗，在保证浸提率的同时应减少溶剂用量。

2.2.2 浸提时间对芥子苷酶提取率的影响

芥子苷酶提取过程中，在其他因素相同的条件下，考察浸提时间对芥子苷酶提取率的影响，见图2。

由图2可知，当浸提时间在1～3 h之间时，芥子苷酶提取率显著上升，从3.18%上升至5.83%；当浸提时间在3～5 h之间时，提取率稍有下降，从5.83%下降至5.76%；当浸提时间在5～6 h之间时，提取率上升幅度很小，从5.76%上升至5.80%。说明当浸提时间达到3 h时，粗酶提取物已完全提取出来，继续增加浸提时间，粗酶提取物的提取率只会小幅度增加，并且不会超过浸提3 h时的最大提取率。

2.2.3 缓冲溶液pH对芥子苷酶提取率的影响

芥子苷酶提取过程中，在其他因素相同的条件下，考察缓冲溶液pH对芥子苷酶提取率的影响，见图3。

由图3可知，缓冲溶液pH在4.0～7.0之间时，芥子苷酶粗提取物的提取率随缓冲溶液pH的升高而上升，从2.63%上升至2.97%；缓冲溶液pH在7.0～8.0之间时，芥子苷酶粗提取物的提取率随缓冲溶液pH的升高反而降低，提取率从2.97%下降至2.56%。这是因为芥子苷酶在pH 7.0时稳定性最好，在pH<7.0时，酶不稳定，且越偏酸环境越不稳定。当提取液pH在7.0时，提取率最高，故提取芥子苷酶应在中性条件下进行。

2.3 芥子苷酶提取正交实验结果与分析

由表4可知，对不同的指标来说，不同因素的影响程度不同，不同指标的对应方案也有所不同，但通过综合平衡法可以得到最终的优方案。

由极差分析可知，各因素对芥子苷酶粗提取物提取率的影响为A>C>B，即液料比对芥子苷酶粗提取物提取率的影响较显著，其次是缓冲溶液pH，最后是浸提时间。最佳组合为A 2B 2C 3，即最优提取条件为液料比3（mL/g）、浸提时间3 h、缓冲溶液pH 7.0。

2.4 芥子苷酶提取正交实验条件的验证实验结果与分析

验证实验结果显示，在该提取条件下萝卜中的芥子苷酶提取率为5.74%，提取率相对较高，且重复性好，说明正交实验所得条件可靠。

2.5 芥子苷酶酶活測定结果与分析

2.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制

绘制葡萄糖标准曲线，得到相关回归方程y=3.255 5x－0.040 4，R2=0.996 1。

2.5.2 芥子苷酶酶活测定结果与分析

由表6可知，加入酶解后的样品0.5 mL，DNS试剂0.5 mL，蒸馏水4 mL，得到3组不同的吸光度值，分别为1.132，1.256，1.159，计算酶解后反应液还原糖总含量分别为0.34，0.38，0.37 mg，酶活分别为95，97，96 U，酶活的平均值为96 U，由芥子苷酶提取率计算公式得出芥子苷酶含量为2.876 g。实验后测定红萝卜中的芥子苷酶活性、含量与何凤平等[6]的测定结果相近，说明实验数据可靠。

3 结论

采用硫酸铵盐析法提取萝卜中芥子苷酶，采用考马斯亮蓝法和双缩脲法对酶粗提取物进行定性分析，以提取率为指标对提取条件进行优化，并采用DNS法测定还原糖含量来反映酶活性。通过以上实验，得到以下结论：

第一，对芥子苷酶粗提取物定性分析时，考马斯亮蓝法和双缩脲法结果均显示粗提物是蛋白质。

第二，芥子苷酶最优提取条件为液料比3（mL/g）、浸提时间3 h、缓冲溶液pH值7.0，此条件下对应的芥子苷酶粗物的提取率为5.74%。

第三，DNS法得到葡萄糖平均含量为96 μmol，芥子苷酶粗提取物活性为96 U，芥子苷酶粗提取物质量为2.876 g。

此研究结果能为红萝卜中芥子苷酶的后续研究提供实验基础，为红萝卜的开发和利用提供科学依据。

参考文献：

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[3]赵大云，杨方琪，郇延军.雪菜中芥子苷酶解特性的研究[J].食品与发酵工业，1997，24（3）：40-46.

[4]徐伟丽，赵国华，李洪军，等.茎用芥菜芥子苷酶的特性研究[J].中国食品学报，2006，6（2）：41-44.

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