前处理方式对冻干鸡肉制备及其特性的影响

张梦琪 管军军 杨国浩 郭珍红 刘艳霞 冯明星

摘要：为了改善冻干鸡肉的生产效率及特性，利用超声波、菠萝蛋白酶、菠萝蛋白酶-超声波联合进行前处理，探究其对冻干鸡肉的影响。结果表明，经超声波、联合处理样品的干燥速率高于未处理组，联合处理样品的总失水率显著高于其他组（P＜0.05）；联合处理样品的肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）溶解度以及电位绝对值显著高于其他组（P＜0.05），其硬度、复水后嫩度、肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）、 MP含量及平均粒径显著低于其他组（P＜0.05）；扫描电镜显示联合处理样品的肌原纤维断裂更明显；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）显示联合处理能够降解肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）、肌动蛋白（actin）和原肌球蛋白（tropomyosin，TM），导致其条带变浅。联合处理有利于冻干鸡肉的制备生产以及感官、理化等特性的改善，能有效提高其品质。

关键词：冻干鸡肉；超声波；菠萝蛋白酶；联合处理

中图分类号：TS251.55      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）07-0001-06

Abstract： In order to improve the production efficiency and characteristics of freeze-dried chicken， freeze-dried chicken are pretreated by ultrasound， bromelain and bromelain-ultrasound combination， and their effects on freeze-dried chicken are investigated. The results show that the drying rate of the samples treated by ultrasound and combination treatment is higher than that of the untreated group （P<0.05）， and the total water loss rate of the sample by combination treatment is significantly higher than that of the other groups （P<0.05）. The solubility and absolute potential of myofibrillar protein （MP） of the sample by combination treatment are significantly higher than those of the other groups （P<0.05）， while the hardness， tenderness after rehydration， myofibril fragmentation index （MFI）， MP content and average particle size are significantly lower than those of the other groups （P<0.05）. The scanning electron microscopy shows that myofibril of the sample by combination treatment cracks more obviously. The sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） shows that the combination treatment could degrade myosin heavy chain （MHC）， actin and tropomyosin （TM）， making their bands become lighter. The combination treatment is conducive to the preparation and production of freeze-dried chicken and the improvement of sensory， physical and chemical characteristics， and effectively improves its quality.

Key words： freeze-dried chicken; ultrasound; bromelain; combination treatment

凍干肉是在真空下由固态冰直接升华成气态水而除去水分制成的一种产品[1]。真空冷冻干燥所得食品的综合品质高于其他方式干燥的食品[2-3]。其产品能长期保存、保留肉品营养风味且适于运输，已出现在方便食品的配料中。同时，国内外正在兴起用冻干工艺制成的速溶鸡汤、速食鸡肉等，国际市场对冻干鸡肉的需求逐年增长。

通过真空冷冻干燥得到的肉制品优势明显，但生产成本高使其推广受限。目前，已有的冻干肉前处理方式主要包括微波、超声波等[4]。二者能缩短冻干时长，但微波易产生高热致品质损坏，超声波能减小破坏[5]。超声波预处理能缓解肉品品质受损与能耗大的问题。

鸡肉具有极高的营养价值与极好的风味，更可以制成鸡肉膏、鸡油用于鸡精的生产[6]。冻干鸡肉运用于汤制品中能够直接提升其鲜味。目前关于冻干肉的报道主要集中在鱼肉、牛肉方面，对冻干鸡肉的报道相对较少。市场上对冻干鸡肉的需求增加，有必要研究不同前处理方式对冻干鸡肉的影响。

菠萝蛋白酶、超声波都广泛运用于肉品的嫩化中，菠萝蛋白酶在肌原纤维层面上实施降解，使肉品嫩化且生成多肽类物质，用于制作功能性产品[7-8]。超声波能加快蛋白质水解、损坏肌肉超微结构，且一定条件下能提高酶的活性[9-10]。而超声波、酶解作为冻干鸡肉前处理方式的研究鲜有报道。因此，本研究探讨了不同前处理方式（超声波、菠萝蛋白酶、菠萝蛋白酶-超声波联合）对冻干鸡肉的影响，为其品质提升奠定了基础，为推广其应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料與试剂

鸡胸肉：双汇冷鲜肉超市；菠萝蛋白酶（300 NFU/mg）：上海源叶生物科技有限公司；牛血清蛋白（≥98%）：北京索莱宝科技有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸二氢钾（≥99.5%）、磷酸氢二钠（≥99.5%）、氯化钠、十二烷基硫酸钠（SDS）等：均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LGJ-12型真空冷冻干燥机 河南兄弟仪器设备有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TMS-Pro型食品物性分析仪 北京盈盛恒泰科技有限责任公司；C-LM3B型数显式肌肉嫩度仪 东北农业大学工程学院；JY600E型电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司；ZS920型纳米粒度仪及Zeta电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司；HH-4型恒温水浴锅 河南智诚科技发展有限公司；722N型可见分光光度计 上海精科实业有限公司；TDL-5-A型离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 冻干鸡肉的制备

将鸡胸肉切成1.5 cm3的块状，分别利用超声波、菠萝蛋白酶、菠萝蛋白酶-超声波联合进行前处理，将样品于-80 ℃预冻12 h后，进行冷冻干燥（温度-60 ℃，真空度0.1 Pa），一定时间后制成冻干鸡肉成品。

超声前处理：超声功率80 W，超声时间25 min；酶解前处理：酶浓度225 U/g，溶液pH 7.0，45 ℃水浴25 min；联合处理：先进行超声前处理后进行酶解处理。

1.3.2 干燥曲线的绘制

取不同冷冻干燥时间（2，4，6，8，10，12，14，16，18 h）的冻干样品，根据式（1）计算其失水率，式（2）计算样品的干燥速率，绘制干燥曲线[11]。

x=m 0－m 1m 0×100%。（1）

式中：x为失水率（%）；m 0为冻干前样品的质量（g）；m 1为冻干后样品的质量（g）。

M=x t+1－x tΔt。（2）

式中：M为干燥速率（%/h）；x为不同时间段样品的失水率（%）；t为时间（h）；Δt为2 h。

1.3.3 硬度的测定

采用TMS-Pro型食品物性分析仪、Texture Lab Pro测试软件，使用圆柱形检测探头，力量感元为100 N，设置高度为50 mm，形变量为50%，测试速度为60 mm/min，在TPA模式下测定成品冻干鸡肉的硬度。

1.3.4 嫩度的测定

将冻干鸡肉完全复水（在45 ℃水中浸泡10 min），置于C-LM3B型数显式肌肉嫩度仪上，沿着逆鸡肉纤维方向测定其嫩度。

1.3.5 肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）的测定

肌原纤维悬浮液的制备在Xu等[12]的方法上进行改进。将冻干鸡肉样品切碎，取 1 g样品于10 mL MFI缓冲液（100 mmol/L KCl，0.1 mmol/L EDTA，1 mmol/L CaCl 2，20 mmol/L KH 2PO 4，pH 7）中，于4 ℃下匀浆30 s后在 4 ℃下以5 000 r/min 离心10 min，将沉淀加入MFI缓冲液中，搅拌均匀，然后重复上述操作，制得MFI悬浮液。用双缩脲法标定其蛋白质浓度，用MFI缓冲液调整最终蛋白质浓度至0.5 mg/mL，并检测悬浮液在540 nm处的吸光度（A 540  nm），MFI = A 540 nm×200。

1.3.6 肌原纤维蛋白含量（myofibrillar protein，MP）的测定

MP含量的测定在Naveena等[13]的方法上改进。测定肌浆蛋白含量与总蛋白含量，肌原纤维蛋白含量为两者之差。

肌浆蛋白含量：称取0.3 g切碎的样品，用10 mL 25 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）提取，采用振荡器均质，2 000 r/min离心15 min，上清液蛋白含量用双缩脲法进行测定。

总蛋白含量：称取0.3 g切碎的样品，用40 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.2，内含1.1 mol/L KI 溶液），采用振荡器均质，2 000 r/min离心15 min，上清液蛋白含量用双缩脲法进行测定。

1.3.7 MP溶解度测定

MP溶解度的测定参考赵颖颖等[14]的方法并改进。取1 g 切碎的样品，将其与10 mL 缓冲液A （20 mmol/L 磷酸盐缓冲液，含100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.0）混合均匀，在4 ℃条件下以5 000 r/min离心10 min，取沉淀，再加入5 mL A，离心，取沉淀，重复此操作2次以上后加入10 mL B （25 mmol/L磷酸盐缓冲液，含0.6 mmol/L NaCl，pH 7.0）溶解2 h，过滤不溶性部分，测定样品液的蛋白浓度，再将其以5 000 r/min离心15 min，取上清液，采用双缩脲法测定其蛋白质浓度。MP溶解度按式（3）计算：

MP溶解度=离心后蛋白质浓度离心前蛋白质浓度×100%。（3）

1.3.8 粒径、Zeta电位的测定

将0.3 g切碎的样品于10 mL（pH 7.0）的磷酸盐缓冲液（10 mmol/L Na 2HPO 4、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L MgCl 2、10 mmol/L EDTA）中均质，以5 000 r/min离心10 min，收集沉淀，加入上述磷酸盐缓冲液，均质、离心，以上步骤重复2次，整个提取过程在 4 ℃下进行，采用双缩脲法固定最终蛋白浓度为1 mg/mL。

测定样品提取液的粒径测定，其测得数据的PDI在0.7以下为有效数据。每个样品测定3次，再将样品提取液注入 Zeta电位仪后进行电位测试，温度为25 ℃，最终电位值取3次测试的平均值[15]。

1.3.9 扫描电镜

用离子溅射仪给样品表面镀一层金属膜，电子扫描显微镜（SEM）在电压3 kV 下进行扫描电镜分析。

1.3.10 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

称取0.3 g样品于10 mL样品提取液（与MFI测定一致）中，匀浆15 s，以5 000 r/min离心15 min，倒去上清液后重新加入提取液，均质、离心，重复3次，取上清液。上清液和样品缓冲液各取50 μL混合均匀后沸水浴4 min，以4 000 r/min离心10 min后上样，上样量为20 μg。初始电压为80 V，进入分离胶后电压改为100 V，电泳结束后用考马斯亮蓝G250染色[16]。

1.4 数据处理

每个试验重复 3次，最终数据以“平均值±标准差”表示。利用 SAS 9.2对数据进行方差分析，采用Fisher's LSD方法作多重比较，P<0.05 表示不同处理组之间差异显著，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 干燥曲线与干燥速率

干燥曲线反映了样品失水率随时间的变化，干燥速率表示样品每2 h所升华的水分含量。不同前处理方式下样品失水率随时间的变化见图1中A。由图1中A可知，样品失水率一直处于上升趋势，在16 h后趋于平缓。菠萝蛋白酶-超声波联合处理样品在18 h内的总失水率显著高于其他组（P＜0.05），由此可以从侧面反映出样品持水力的高低：菠萝蛋白酶-超声波联合＞酶解＞超声＞未处理（P＜0.05）。由图1中B可知，样品的干燥速率呈先上升后下降的趋势。0～4 h干燥速率提高显著（P＜0.05），4～18 h逐渐下降；并且在0～6 h内，超声处理的样品干燥速率高于其他处理组（P＜0.05）。

肌原纤维蛋白的稳定性、完整性和空间构型可以直接影响组织中的水分含量。研究发现，酶处理与超声处理增加了肌原纤维的降解，肌肉纤维体积减少而从肌纤维晶格结构中消失，水渗入肌原纤维网络，导致菠萝蛋白酶-超声波联合组持水力最高[17]。另一方面，超声处理可以改变物料的组织结构，物料因反复受到压缩和拉伸作用而不断收缩和膨胀，形成海绵效应，当这种结构效应产生的作用力大于水分的表面附着力时，水分就容易转移出来，从而提高干燥速率。Zhang等[18]的研究也发现超声波作为前处理能够有效缩短猪肉的冷冻干燥时间。

2.2 硬度与嫩度

硬度、嫩度越低，样品肌原纤维受损程度越大。试验发现，未处理的样品表面条状纤维较明显，而其他3种前处理的样品表面纤维较模糊，尤其是酶处理与联合处理最明显。由图2可知，测定冻干鸡肉的硬度以及复水后嫩度表明，未处理组样品的硬度、嫩度显著高于其他处理组（P＜0.05）。

肉类的主要成分是肌原纤维，主要由肌动蛋白、肌球蛋白和其他辅助蛋白组成，此外，还有不同亚型的胶原和弹性蛋白的结缔组织[19]。肌原纤维蛋白的稳定性和结缔组织强度对肌肉质地起着重要的作用。在超声波的空化作用下，细胞结构受到破坏，蛋白质的内外结构发生变化，削弱了肌纤维内部结构的相互作用，降低了冻干制品的硬度，复水后肉品的嫩度也随之减小[20]。菠萝蛋白酶能够水解肌原纤维蛋白，导致肌原纤维蛋白断裂和结缔组织破坏，冻干样品的硬度以及复水后嫩度也都降低[21]。单一酶处理和超声波处理对冻干鸡肉的硬度均有效果，联合处理时超声波诱导肌原纤维蛋白分子展开，肌原纤维蛋白高级结构在酶的作用下被破坏，所以菠萝蛋白酶-超声波联合处理组的硬度、嫩度最低，這与Lee等[22]的研究中超声波可显著增强酶活性的结果一致。

2.3 MFI、MP含量与MP溶解度

MFI是肌原纤维碎裂程度的指标，MFI越高表明肌原纤维结构的完整性受到越大程度的破坏。由图3中A可知，未处理组的 MFI 最低（68.4），经超声波、菠萝蛋白酶前处理后，MFI分别增加到84.4和97.6，菠萝蛋白酶-超声波联合处理组的MFI最高（113），比未处理组提高了65.2%（P＜0.05）。MP是鸡肉中的主要蛋白，也是构成肌肉层状网络结构的主要蛋白。Huang等[23]研究表明，肌肉的组成与MP的降解程度可直接影响肉的品质。由图3中B可知，超声波和菠萝蛋白酶前处理可显著降低MP含量（P＜0.05）。未处理样品的 MP含量（102.53）显著高于其他处理组（P＜0.05）。联合处理组MP溶解度显著高于其他处理组，其余依次是酶处理＞超声处理＞未处理（P＜0.05）。

因为蛋白酶可以通过特定连接区域有效地破碎肌肉肌原纤维，导致MFI升高[24]，且酶处理后能够溶解有序的丝状肌球蛋白，减小MP 颗粒，增加了MP 颗粒的比表面积，提高水分子与MP间的相互作用力，MP 溶解度随之增加，MP含量下降[14]。而超声能使肌浆和肌纤维蛋白切割或溶解，导致MFI增大。随后，超声促进蛋白质结构展开，使亲水氨基酸暴露在外层，提高 MP的溶解性，降低 MP 含量；此外，由于联合使用时，超声可以增加酶的活性，促使菠萝蛋白酶在肉中的渗透，从而使菠萝蛋白酶有效地降解肌肉肌原纤维，导致MFI、MP溶解度最高，MP含量最低（P＜0.05）。

2.4 粒径、Zeta电位

蛋白质的粒径能够影响蛋白质的功能特性，同时也体现了蛋白质宏观结构。由图4中A可知不同处理方式所对应样品的MP 粒径分布，经过菠萝蛋白酶、超声波以及联合处理的样品呈现较窄单峰且逐渐向小粒径分布方向移动，且不同前处理样品组间差异显著（P＜0.05），说明菠萝蛋白酶、超声波处理都能有效降低肌原纤维的粒径并且提高肌原纤维分布的均匀性。由图4中B可知不同处理方式所对应样品的平均粒径大小依次为未处理（613.67±27.39） nm＞超声处理（453.00±2.52） nm＞酶解处理（403.00±2.00） nm＞联合处理（357.33±11.02） nm（P＜0.05）。Bai等[25]发现超声能够有效减小肌球蛋白粒径。在超声处理过程中，粒径降低可能是超声产生的激流撞击使得MP 之间的非共价键被打断，大聚体破碎，导致粒径减小。菠萝蛋白酶能够使蛋白质结构受到破坏，蛋白变成小片段，从而使粒径减小。而菠萝蛋白酶-超声波联合处理可能使该现象效果叠加，故此时粒径最小（P＜0.05）。此结果与 MP 溶解度的增加相符。

由图4中B可知，不同前处理方式样品的电位大小依次为未处理＞超声处理＞酶解处理＞联合处理。菠萝蛋白酶-超声波联合处理组（－5.75±0.10） mV的电位绝对值显著高于其他处理组（P＜0.05）。这可能是超声波处理导致 MP展开，带负电的氨基酸得以暴露，蛋白质间静电斥力增强，电位绝对值增大[26]；同时，菠萝蛋白酶可能拥有更强的分解蛋白质的能力，使蛋白分子间发生解离，更多氨基酸暴露出来，导致表面负电荷增多，静电斥力增大，电位绝对值增大。所以，当菠萝蛋白酶与超声波联合作用时，静电排斥力占主导地位，电位绝对值最大（P＜0.05）。

2.5 扫描电镜

扫描电子显微镜能利用聚焦的高能电子束进行样品微观形貌的观察。未处理的冻干鸡肉样品肌原纤维整体完整，结构紧密，排列次序非常规则，肌纤维未发生断裂（见图5中A的椭圆圈）；超声前处理组样品的肌原纤维结构排列已经发生改变，不再致密、有序（见图5中B的椭圆圈）。这可能是由于超声产生的空化效应在介质中产生作用，引起胞内振动，拉扯肌原纤维，使其间隙变大，破坏了肌纤维结构的完整性；菠萝蛋白酶前处理组样品的肌原纤维结构被破坏，断裂明显（见图5中C的椭圆圈）。这可能是因为菠萝蛋白酶作为一种参与肌原纤维蛋白分解的主要外源性酶，能够对肌肉细胞中蛋白质产生强烈的分解作用，使结缔组织受到破坏，肌原纤维断裂明显[27]；而菠萝蛋白酶与超声波联合使用时，肌原纤维间隙变大，断裂明显（见图5中D的椭圆圈）。这是由于菠萝蛋白酶使样品内部的肌原纤维蛋白和结缔组织分解，随后在超声波处理产生的较大压力下，肌原纤维进一步分解、断裂，使其结构更加松散、无序，这也与前文MFI测定结果相符。

2.6 SDS-PAGE

利用SDS-PAGE可以检测不同前处理样品中蛋白质的组成。不同前处理方式冻干鸡肉MP的SDS-PAGE图谱见图6，在所有样品中都能观察到肌球蛋白重链（MHC，200 kDa）、肌动蛋白（Actin，45 kDa）、原肌球蛋白（TM，36 kDa）谱带[28]。MP 的主要成分是肌球蛋白重链和肌动蛋白。在肌肉中，MHC是最容易降解的蛋白质，Actin和其他蛋白质直到MHC不可用时才被降解[29]。

由图6可知，未处理组的条带明显更深，而其他处理方法对应样品的蛋白质谱发生了显著变化，说明经过前处理后，样品的MP都发生了不同程度的降解。其中，与未处理组样品相比，酶处理、超声处理以及菠萝蛋白酶-超声波联合处理组样品的MHC条带明显变浅，在75～220 kDa范围内检测到一些小条带，这些较低分子量的条带可能是蛋白质降解的产物[30]；Actin与TM条带在菠萝蛋白酶-超声波联合处理中最浅，其次是酶解、超声波。这是因为蛋白酶处理和超声波处理能使蛋白分子结构被破坏甚至降解，产生一些小肽和蛋白短片段，从而导致条带变浅。这些结果与前文MP含量、微观结构和MFI值等结果相符。

3 结论

本研究采用超声、菠萝蛋白酶以及菠萝蛋白酶-超声波联合作为前处理方式，探讨了不同前处理方式对冻干鸡肉制备过程及其相关特性的影响。得到结论：第一，由干燥曲线可知，超声波处理与联合处理样品的干燥速率高于未处理组，联合处理的总失水率显著高于其他组（P＜0.05）。第二，菠萝蛋白酶-超声波联合处理样品的MP溶解度、电位绝对值显著高于其他组（P＜0.05）；样品的硬度、复水后嫩度、MFI、MP含量、平均粒径显著低于其他组（P＜0.05）。第三，扫描电镜显示菠萝蛋白酶-超声波联合处理肌原纤维间隙、断裂更明显。第四，SDS-PAGE显示菠萝蛋白酶-超声波联合处理能够降解MHC、Actin以及TM，导致其条带变浅。

因此，超声波与菠萝蛋白酶-超声波联合处理都能提高冻干鸡肉制备过程中的干燥速率，而联合处理可以通过改变冻干鸡肉的MP组织与分子结构，从而改善其硬度、嫩度等感官特性以及MFI、MP含量等理化特性。本研究进一步提高了冻干鸡肉的经济价值，为拓宽冻干鸡肉速食品中的开发与应用提供了科学依据。

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