双酶法制备条斑紫菜酶解液工艺优化及抗氧化、抗疲劳活性研究

张梦雪 叶静静 高子鑫 沈祥皓 胡金雨 盘赛昆

摘要：研究双酶法制备条斑紫菜酶解液工艺优化及其抗氧化、抗疲劳活性。以水解度为指标，经筛选确定由中性蛋白酶和碱性蛋白酶复配，通过单因素试验和响应面优化试验得到最优工艺条件：中性蛋白酶与碱性蛋白酶添加量比例为1∶3，酶解pH为 8，加酶量为2.0%，酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h。该条件下酶解液水解度为33.81%，对DPPH、ABTS+、OH自由基有一定的清除能力，并能够提高小鼠的运动耐力，延长力竭游泳时间，降低运动后血乳酸水平，为条斑紫菜后期加工利用提供了理论依据。

关键词：条斑紫菜；双酶水解；工艺优化；抗氧化；抗疲劳

中图分类号：TS254.58      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）07-0007-07

Abstract：The process optimization， antioxidant and anti-fatigue activities of the enzymatic hydrolysate of Porphyra yezoensis prepared by double-enzyme method are studied. With the degree of hydrolysis as the index， the combination of neutral protease and alkaline protease is determined through screening.Through single factor test and response surface optimization test， the optimum technological conditions are determined as follows： the ratio of neutral protease to alkaline protease is 1∶3， the enzymolysis pH is 8， the enzyme addition amount is 2.0%， the enzymolysis temperature is 50 ℃ and the enzymolysis time is 2 h. Under these conditions， the degree of hydrolysis of the enzymatic hydrolysate is 33.81%， and it has a certain scavenging capacity on DPPH， ABTS+， OH free radicals， and can improve the exercise endurance of mice， prolong the exhaustion swimming time， and reduce the level of blood lactic acid after exercise. The research has provided a theoretical basis for the later processing and utilization of Porphyra yezoensis.

Key words： Porphyra yezoensis； double-enzyme hydrolysis； process optimization； antioxidation； anti-fatigue

條斑紫菜（Porphyra yezoensis）隶属于红藻门，为我国的主要经济藻类之一，具有较高的食用价值。有研究表明，干条斑紫菜含有蛋白质、多糖、牛磺酸、矿物质和膳食纤维，还含有多肽、多酚类等生物活性物质[1-3]，脂肪含量仅占1%左右。多肽、多糖、牛磺酸等活性物质具有抗氧化、抗疲劳、调节免疫力、降血脂等多种生理功能[4-7]。因此，可以认为条斑紫菜是一种低脂肪的优质海洋食品。利用酶法制备生物活性物质已广泛用于食品工业中，其反应条件温和，专一性强，反应进程容易控制，绿色无污染[8]。仅用一种酶对条斑紫菜进行酶解的不足之处是水解度低、活性低，而不同蛋白酶的作用位点有很大差异，采用双酶协同酶解是提高水解度的可行方法[9]。因此，采用双酶法能得到水解度较高的条斑紫菜酶解液，提高条斑紫菜的利用价值。

试验以干条斑紫菜为原料，采用双酶法制备条斑紫菜酶解液。以水解度为评价指标，对其酶解工艺进行优化，并对其产物的抗氧化和抗疲劳活性进行初步研究，以期为条斑紫菜的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干条斑紫菜：连云港力优食品有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶：河南万邦化工科技有限公司；盐酸、氢氧化钠、甲醛、DPPH、ABTS、OH、无水乙醇、过硫酸钾、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢等：均为分析纯，江苏一青生物科技有限公司；乳酸（LD）测试盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 试验动物

SPF级雄性健康小鼠：质量（20±2） g，扬州大学比较医学中心。

1.3 主要仪器与设备

PHSJ-3F实验室pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；SHA-2数显冷冻水浴恒温振荡器 江苏金坛市亿通电子有限公司；SP-754紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DDL-5M低速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 紫菜酶解液的制备

参照刘冰等[10]的方法稍加修改，干条斑紫菜经超微粉碎，过80目筛，按料液比1∶30（g/mL）向干条斑紫菜粉中加入蒸馏水，于湿法粉碎机中在频率35 Hz下粉碎1 h，按质量分数加入5%纤维素酶，25 ℃酶解6 h，制得紫菜匀浆溶液。调节溶液pH，加蛋白酶酶解，沸水灭酶10 min，5 000 r/min离心20 min，取上清液制得紫菜酶解液。

将紫菜酶解液冷冻干燥，于4 ℃冰箱中保存，用于研究抗氧化性和抗疲劳性时配制成不同浓度的酶解液。

1.4.2 蛋白酶筛选试验

选用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶5种蛋白酶在各自适宜条件下酶解得紫菜初提液，每隔1 h取样沸水灭酶，取上清液测其水解度，共计5 h。以水解度为筛选指标，筛选出两种适宜酶解干条斑紫菜的酶。

1.4.3 单因素试验

以酶解液的水解度为评价指标，考察酶配比、酶解pH、加酶量、酶解温度及酶解时间5个因素对水解度的影响。

1.4.3.1 酶配比对水解度的影响

在酶解pH 8、酶解温度50 ℃、加酶量20 000 U/g·pro、酶解时间2 h的条件下，研究加酶量配比为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4时对水解度的影响。

1.4.3.2 酶解pH对水解度的影响

在酶配比1∶3，酶解温度50 ℃、加酶量20 000 U/g·pro、酶解时间2 h的条件下，研究酶解pH为6，7，8，9，10时对水解度的影响。

1.4.3.3 加酶量对水解度的影响

在酶配比1∶3、酶解pH 8、酶解温度50 ℃、酶解时间2 h的条件下，研究加酶量为10 000，15 000，20 000，25 000，30 000 U/g·pro时对水解度的影响。

1.4.3.4 酶解温度对水解度的影响

在酶配比1∶3、酶解pH 8、加酶量20 000 U/g·pro、酶解时间2 h的条件下，研究酶解温度为40，45，50，55，60 ℃时对水解度的影响。

1.4.3.5 酶解时间对水解度的影响

在酶配比为1∶3，酶解pH 8，加酶量20 000 U/g·pro、酶解温度50 ℃的条件下，研究酶解时间为1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h时对水解度的影响。

1.4.4 響应面优化试验

根据单因素试验结果，从5个单因素中选择对水解度影响显著的3个因素，使用Design-Expert 13软件，以水解度为响应值，设计三因素三水平试验，具体响应面试验因素水平见表1。

1.4.5 水解度的测定

参照张修正等[11]的方法测定。水解度测定的计算公式如下：

水解度（%）=XN×100。

式中：X为酶解上清液中游离氨基酸态氮含量，g；N为样品中总氮含量，g。

1.4.6 体外抗氧化活性研究

以DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率为指标，V C作为阳性对照，研究条斑紫菜酶解液的抗氧化活性。

1.4.6.1 DPPH自由基清除率的测定

参照刘静等[12]的方法稍加修改，取酶解液2 mL，加0.1 mmol/mL DPPH溶液2 mL，室温避光反应30 min，无水乙醇作为参比溶液，在517 nm处测定吸光值（A 1），同时测定2 mL酶解液和2 mL无水乙醇混匀后的吸光值（A 2），2 mL无水乙醇和2 mL DPPH溶液混匀后的吸光值（A 3），计算DPPH自由基清除率。

DPPH·清除率（%）=（1－A 1－A 2A 3）×100。

1.4.6.2 ABTS阳离子自由基清除率的测定

参照赵世光等[13]的方法，配制在734 nm处吸光值达到0.7±0.02的ABTS阳离子溶液，取1 mL酶解液与4 mL ABTS+·混合，精确避光反应6 min，在734 nm处测定吸光值（A 1），同时测定1 mL酶解液与4 mL无水乙醇混合后的吸光值（A 2），1 mL无水乙醇和4 mL ABTS+·混合后的吸光值（A 3），计算ABTS+·清除率。

ABTS+·清除率（%）=（1－A 1－A 2A 3）×100。

1.4.6.3 羟自由基清除率的测定

参照许继业等[14]的方法，向试管中依次加入9 mmol/L水杨酸-乙醇、9 mmol/L FeSO 4、酶解液、8.8 mmol/L H 2O 2各1 mL，37 ℃水浴15 min，在510 nm处测吸光值（A 1），按上述操作用蒸馏水替换酶解液测吸光值（A 2），蒸馏水替换H 2O 2测吸光值（A 3），计算羟自由基清除率。

·OH清除率（%）=（1－A 1－A 2A 3）×100。

1.4.7 体内抗疲劳活性研究

参照马晓宁等[15]的方法并加以修改。将小鼠随机分成4组，分别为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组20只小鼠，低剂量组每天经口灌胃0.1 mg/g紫菜酶解液、中剂量组0.2 mg/g紫菜酶解液、高剂量组0.3 mg/g紫菜酶解液。为方便灌喂，将冻干后的紫菜酶解液配成各剂量组相对应浓度的溶液。空白对照组替换为等量的生理盐水，各试验组动物经口灌胃连续给予30 d。

1.4.7.1 力竭游泳试验

参照瞿东杨等[16]的方法，每组取10只小鼠，在第30天灌喂样品30 min后，在小鼠尾部负其质量5%的铅块，置于水深35 cm、水温25 ℃的游泳箱中游泳。游泳期间如有弓腰停止、悬浮休息者，用玻璃棒刺激游动以防偷懒，当小鼠沉入水下10 s不能浮出水面则视为力竭，用秒表记录从游泳开始至力竭的时间作为小鼠力竭游泳时间。

1.4.7.2 血乳酸含量的测定

参照卓长清等[17]的方法并加以修改，取剩余小鼠，灌喂样品30 min后，于游泳箱中无负重游泳15 min，断尾取血，血浆静置1 h后，4 000 r/min离心30 min，取血清按照乳酸测试盒操作方法测定游泳前、游泳后0 min和游泳后20 min时乳酸含量。

1.4.8 数据处理

采用SPSS 23软件进行单因素试验方差分析，当P<0.05时表示具有显著性差异；采用Origin 2018软件作单因素试验结果图；采用Design-Expert 13软件进行响应面试验结果分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选试验结果

由图1可知，选取的5种蛋白酶对条斑紫菜的水解度都有效果，由于不同蛋白酶的作用位点有所不同，不同蛋白酶作用后的水解度有所区别。结果表明，碱性蛋白酶作用的水解度最高，其次是中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶，木瓜蛋白酶最低，说明碱性蛋白酶和中性蛋白酶的水解效果较好，因此选用这两种酶对条斑紫菜进行酶解。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶配比对水解度的影响

由图2可知，随着中性蛋白酶与碱性蛋白酶配比的减小，水解度呈现先上升后下降的趋势，在1∶3时最高，水解度为36.52%。说明两种酶作用的酶切位点有所不同，有互补的作用，能够提高水解度[18]。因此，选择中性蛋白酶与碱性蛋白酶的配比为1∶3作为单因素最适酶配比。

2.2.2 酶解pH对水解度的影响

由图3可知，在pH为6～10时，随着pH的增大，水解度呈现先上升后下降的趋势，且具有显著性差异（P<0.05）。条斑紫菜的水解度在复配后的复合酶pH为7～9之间较高，说明复配后的复合酶在pH 7～9范围内活力较好，且当pH为8时，水解度达到最大值31.47%。因此，选择pH为7，8，9 3个水平进行响应面优化。

2.2.3 加酶量对水解度的影响

由图4可知，条斑紫菜的水解度在加酶量从10 000 U/g·pro增加到20 000 U/g·pro上升显著（P<0.05）；在加酶量为20 000 U/g·pro时，水解度达到最大值32.35%；在加酶量大于20 000 U/g·pro后，水解度下降并趋于平缓。酶的本质是蛋白质，加酶量超过其最适加酶量时，所加酶不仅作用于底物，还作用于蛋白酶，从而影响酶对底物的水解，导致水解度下降[9]。因此，复合酶添加量的较适范围在15 000～25 000 U/g·pro之间。

2.2.4 酶解温度对水解度的影响

由图5可知，酶解温度在40～60 ℃范围内，水解度随着温度的增加呈现先上升后下降的趋势，且有显著性差异（P<0.05）。在50 ℃时达到较高值32.45%。温度是影响酶活性变化的主要因素之一，在最适温度条件下酶能表现出最大的活性，不在最适温度范围时，酶的活性受到抑制，从而降低了对底物的水解能力，水解度下降[19]。根据试验结果，选择酶解温度45，50，55 ℃作为响应面试验的因素水平。

2.2.5 酶解时间对水解度的影响

由图6可知，随着酶解时间的延长，条斑紫菜的水解度呈现先上升后基本不变的趋势。在2 h时水解度达到最大值33.85%，随后保持平缓，无显著性差异（P＞0.05）。这是由于随着酶解时间的延长，条斑紫菜逐渐被水解，水解度增加；2 h后反应趋于饱和状态，水解度趋于稳定水平。因此，选择酶解时间2 h作为最佳工艺条件。

2.3 响应面试验结果

双酶法制备紫菜液工艺各因素间存在交互作用，根据单因素研究结果，为确定最佳工艺，选择酶解pH（A）、加酶量（B）和酶解温度（C）3个因素，设计响应面试验，结果见表2。

通过Design-Expert 13软件对试验结果进行二次多项式回归拟合，得到水解度（Y）与各因素的二次回归方程模型：Y=33.82－0.090 0A+0.140 0B－0.547 5C+0.087 5AB+0.837 5AC－0.077 5BC－2.08A2－3.72B2－2.88C2。

由表3可知，回归模型的P＜0.000 1，极显著，失拟项的P=0.987 4＞0.05，不显著，表明此模型的拟合度较好，误差小。模型的相关系数R2=0.999 5，说明该模型具有可信度，可用该方程来描述各变量与响应值之间的关系，可以用于制备条斑紫菜液工艺优化的预测。在回归模型中，一次项B、C，交互项AC，二次项A2、B2、C2都表现出极显著水平；一次项A表现出显著水平。根据各变量P值的大小，可以判断出各因素对条斑紫菜水解度影响的大小为酶解温度＞加酶量＞酶解pH。

2.4 因素间的交互作用对条斑紫菜水解度影响的响应面和等高线分析

由表3和图7可知，加酶量和酶解温度对水解度的影响极显著（P＜0.01），酶解pH与酶解温度的交互作用极显著（P＜0.01），酶解pH与加酶量、加酶量与酶解温度的交互作用不显著。以水解度为响应值，采用响应面分析软件优化得到双酶法制备条斑紫菜酶解液的工艺条件为酶解pH 7.95、加酶量2.01%、酶解温度49.49 ℃，在此条件下水解度的预测值为33.85%。

2.5 验证试验

结合实际操作情况，将优化后的工艺调整为中性蛋白酶与碱性蛋白酶的配比1∶3、酶解pH 8、加酶量2.0%、酶解温度50 ℃、酶解时间2 h。进行3次验证试验，其水解度平均值为33.81%，用SPSS软件进行单样本T检验，显著性为0.128＞0.05，说明验证值与预测值差异不显著，此模型可信。

2.6 抗氧化活性研究结果

2.6.1 DPPH·清除率

由图8可知，在底物浓度为2～20 mg/mL范围内，随着条斑紫菜酶解液浓度的增加，DPPH自由基清除率呈上升趋势，当浓度增加到15 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到97.82%，接近于V C对DPPH自由基的清除效果。

2.6.2 ABTS+·清除率

由图9可知，在底物浓度为2～20 mg/mL范围内，随着底物浓度的增加，条斑紫菜酶解液对ABTS+·的清除率呈上升趋势。当浓度达到10 mg/mL時，清除率为99.80%，并不再增加，处于稳定状态，与V C的作用效果相当。

2.6.3 ·OH清除率

由圖10可知，在底物浓度为2～20 mg/mL范围内，随着底物浓度的增加，条斑紫菜酶解液对·OH的清除率呈上升趋势，浓度为20 mg/mL时，清除率为70.29%。整体来看，同浓度下条斑紫菜酶解液对·OH的清除效果不及Vc。

2.7 抗疲劳活性研究结果

2.7.1 条斑紫菜酶解液对小鼠力竭游泳时间的影响

由表4可知，低、中、高剂量组小鼠力竭游泳时间都显著高于空白对照组，能有效延长游泳时间，而运动耐力能够宏观反映机体的抗疲劳能力，力竭游泳时间是衡量机体抗疲劳能力最直接的指标[20]。表明优化后的双酶法制备紫菜酶解液工艺条件下得到的紫菜酶解液对小鼠耐力的提高有效果。

2.7.2 条斑紫菜酶解液对小鼠血乳酸水平的影响

一般情况下，机体剧烈运动时会产生大量乳酸，导致肌肉酸碱值下降，代谢失调，会引起疲劳。乳酸在肌肉中堆积越多，疲劳程度越严重[16]。由表5可知，运动后的小鼠体内乳酸含量迅速上升，在体内堆积，休息20 min后，机体内乳酸含量逐渐下降。通过显著性分析可知，与空白对照组相比，低、中、高剂量组小鼠运动后血乳酸水平都显著降低（P<0.05），表明低、中、高剂量组紫菜酶解液都可以降低小鼠运动后血乳酸水平。

3 结论

本文对双酶法制备条斑紫菜酶解液工艺进行了优化，并对其产物进行了抗氧化和抗疲劳研究。在实验室条件下，双酶法制备条斑紫菜液工艺优化后条件为中性蛋白酶与碱性蛋白酶比例1∶3、酶解pH 8、加酶量2.8%、酶解温度50 ℃、酶解时间2 h。该条件下水解度为33.81%，相比单酶法有显著提高，提高了条斑紫菜的利用率。体外抗氧化试验和体内抗疲劳试验研究结果表明，条斑紫菜酶解液具有抗氧化和抗疲劳作用，能提高对自由基的清除能力和运动耐力，为条斑紫菜的应用研究提供了参考。

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