生姜蛋白酶无机大分子杂化纳米花的制备与研究

罗璇 陈玥 雷晶晶 马才学 沈瑞敏

摘要：为提高游离生姜蛋白酶的酶活力，文章利用生姜蛋白酶和无机金属盐离子通过组装的方法成功合成了一种具有多级花状结构的新型纳米材料。通过扫描电子显微镜确定了生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的组成和结构，并进一步优化了生姜蛋白酶无机大分子杂化纳米花的制备条件，研究了其酶学性质和使用稳定性，初步探索了纳米花酶活力与其形貌结构的关系。实验结果表明，以生姜蛋白酶为有机成分，磷酸铜为无机成分，制备的酶-无机杂化纳米花的形貌结构与酶浓度、Cu2＋浓度、pH、温度等因素密切相关，纳米花外表圆润、花瓣饱满、形状规整、粒径相似时，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的酶活也更高。当酶浓度为0.5 mg/mL、CuSO 4浓度为0.8 mol/L、pH为6.0、温度为4 ℃时，酶活力最高，可达到10 302.2 U/mg，是游离生姜蛋白酶的7 000%，温度、酸碱稳定性较高，重复使用性较好。

关键词：生姜蛋白酶；无机杂化纳米花；形貌结构；固定化酶

中图分类号：TS201.25      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）07-0081-07

Abstract： To improve the enzyme ability of free ginger protease， in this paper， a new type of nano material with multistage floral structure is successfully synthesized by assembly of ginger protease and inorganic metal salt ions. The composition and structure of ginger protease-inorganic hybrid nanoflower are determined by scanning electron microscopy， the preparation conditions of ginger protease inorganic macromolecule hybrid nanoflower are further optimized， the enzymatic properties and use stability are studied，and the relationship between nanoflower enzyme activity and its morphological structure is preliminarily explored. Experimental results show that with ginger protease as the organic component， copper phosphate as the inorganic component， the morphological structure of the prepared enzyme-inorganic hybrid nanoflower is closely related to enzyme concentration， Cu2+ concentration， pH， temperature and other factors. When nanoflower has round appearance， plump petals， regular shape and similar particle size， ginger protease-inorganic hybrid nanoflower enzyme activity is higher. When the enzyme concentration is 0.5 mg/mL， the CuSO 4 concentration is 0.8 mol/L， the pH is 6.0， and the temperature is 4 ℃， the enzyme ability is the highest， which can reach 10 302.2 U/mg， 7 000% of free ginger protease enzyme activity. The temperature and acid-base stability is higher， and the reusability is better.

Key words： ginger protease; inorganic hybrid nanoflower; morphological structure; immobilized enzyme

生姜蛋白酶是一種新型天然植物蛋白酶，因为其良好的药用价值和在食品添加剂中的广泛应用，具有很大应用前景[1]。但因为游离生姜蛋白酶的不稳定性，利用现有固定化技术，酶活性不高，稳定性不强，导致少有人对其关注，使得该酶未发挥出其应有的作用[2-3]。

通过固定化作用，可以优化酶学性质，增加酶与底物的适用性。酶通过杂化纳米修饰具有独特的优势，一是因为酶杂化纳米花的制备过程简单，且不涉及任何剧烈的反应条件，因此能有效地降低固定化过程中酶活的损失；二是酶杂化纳米花具有独特的形貌特征和理化特性，如较高的比表面积、稳定的金属骨架，因此能显著提升酶的稳定性、催化效率以及重复利用性[4-6]。

近年来，多种酶已经和无机物材料成功形成固定化组装，并且显著提高了其酶活、重复使用次数和稳定性。有文献表明，蔗糖异构酶Pal I结合Cu2+制备纳米花固定化酶，其固定化结构明显提高了酶的稳定性，且具有较好的循环性能[7]；利用含Cu2+的无机物与蛋白质杂化可以形成杂化纳米花，并且酶的稳定性及使用效率显著提高[8]。

本文利用生姜蛋白酶结合Cu2＋成功合成了一种新型纳米花结构材料，并且优化了其制备条件，通过扫描电镜（SEM）确定了生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的组成和结构，并对其结构和性质进行了分析和测试，研究了其酶活力、稳定性及重复利用性。这种新型的生姜蛋白酶-无机杂化纳米生物催化剂将在化工、生化、制药和生物技术等工业过程中具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜生姜：市售；磷酸氢二钠、三氯乙酸、氢氧化钠、三水醋酸钠、氯化钾、磷酸二氢钠、氯化钠、硫酸铜、葡聚糖凝胶G-50（均为分析纯）；干酪素、酪氨酸、福林酚试剂（均为生物纯）。

1.2 仪器与设备

JSM-6010LA扫描电子显微镜 日本电子株式会社；FD-1A-50真空冷冻干燥机 上海继谱电子科技有限公司；UV2000紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；TG16-WS离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；AP224X电子天平 岛津仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生姜蛋白酶液的制备[9]

取外形完好、无腐烂和机械损伤的新鲜生姜50 g，洗净，切成小块后，加入2倍体积的PBS缓冲液（0.05 mol/L，pH 6.0）研磨30 min，过滤，将滤液收集置于4 ℃冰箱中，2 h后以4 000 r/min离心10 min，上清液即为生姜蛋白酶粗酶液。Sephadex G-50纯化生姜蛋白酶，选择磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 6.0），柱床高度50 cm，上样量3 mL粗酶，流速45 cm/h，洗脱液总用量150 mL对粗酶液进行Sephadex G-50纯化。采用福林酚法测其初始酶活。

1.3.2 酪氨酸标准曲线的制作[10]

参考文献[10]，以酪氨酸的浓度（μg/mL）为横坐标、A 660 nm为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 生姜蛋白酶酶活的测定

参考团队前期的研究成果，分别取生姜蛋白酶酶液和离心后剩余的酪蛋白及酶蛋白沉淀物1 mL于水浴预热2 min，混合均匀后继续恒温反应10 min，加入 0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，沉淀残余蛋白。离心，取 1 mL上清液，加入0.4 mol/L的碳酸钠5 mL和1 mL稀释后的福林酚试剂，混合均匀，在40 ℃水浴显色10 min，采用可见分光光度计测其在680 nm处的吸光度。

生姜蛋白酶活力（U）＝A×K×N×7/10。

式中：A为样品的平均吸光度值；K为100除以酪氨酸标准曲线上100 μg/mL对应680 nm处的吸光度值；N为酶液稀释倍数；7为反应液总体积；10为酶液分解酪蛋白反应时间10 min。

固定化酶相对酶活力（%）＝每次使用后固定化酶活力/最高固定化酶活力×100。

1.3.4 酶-無机杂化纳米花的制备工艺优化[11-12]

1.3.4.1 不同Cu2+浓度下无机杂化纳米花的制备

配制不同浓度的CuSO 4溶液（0，0.4，0.8，1.0 mol/L），各取0.2 mL于30 mL烧杯中，并加入用PBS缓冲液配制的酶浓度为1 mg/mL的生姜蛋白酶液30 mL。摇匀后室温静置培养72 h，分别取上层液体和下层固体测其酶活，收集沉淀，蒸馏水洗涤3次，然后以4 000 r/min 离心后，收集沉淀，真空冷冻干燥得到纳米花。

1.3.4.2 不同酶浓度下无机杂化纳米花的制备

用PBS分别配制不同浓度的生姜蛋白酶液（0，0.5，1.0，2.0 mg/mL），取30 mL于烧杯中，并分别加入0.2 mL 0.8 mol/L的CuSO 4溶液，摇匀后静置培养72 h。

1.3.4.3 不同pH下无机杂化纳米花的制备

配制0.01 mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液，利用NaOH溶液或者盐酸溶液将PBS缓冲液的pH分别调至6.0，8.0，10.0，分别配制不同pH的1 mg/mL的生姜蛋白酶溶液，再加入0.2 mL 0.8 mol/L的CuSO 4溶液。

1.3.4.4 不同温度下无机杂化纳米花的制备

将0.8 mol/L的CuSO 4溶液各取0.2 mL加入3个烧杯中，再加入用PBS缓冲液配制的酶浓度为1 mg/mL的生姜蛋白酶液30 mL，分别置于－20，4，20 ℃（室温）下培养72 h。

1.3.5 酶-无机杂化纳米花包埋率的测定

未知样品中蛋白质含量的测定：取1 mL待测上清液，加入4 mL考马斯亮蓝，在595 nm处测定其吸光度值，根据标准曲线求得上清液中酶的含量。通过比较纳米花合成前初始酶浓度与纳米花合成后上清液中的酶含量，计算纳米花的包埋率：

E=C r-C sC r×100%。

式中：C r为初始酶浓度（mg/mL）；C s为上清液中酶含量（μg/mL）。

1.3.6 酶-无机杂化纳米花实际酶含量的测定及其煅烧温度的确定[13]

实际酶含量的测定：通过高温煅烧，去除纳米花中的有机成分，再通过煅烧前后重量的3次重复对比确定纳米花中实际酶含量：

W=G N-G 0G N×100%。

式中： G N为纳米花的质量（g）； G 0为Cu 3（PO 4）·3H 2O的质量（g）。

煅烧温度的确定：分别称取200 mg纳米花样品于马弗炉中煅烧2 h，设置煅烧温度分别为500，550，600，650，700 ℃。观察煅烧后残余粉末达到恒重时的温度即为煅烧温度。

1.3.7 酶-无机杂化纳米花热稳定性的测定

测定固定化和游离生姜蛋白酶在不同温度（20～80 ℃）条件下的酶活力，确定最适温度。然后将两种酶分别在不同温度下处理1 h，在最适温度下检测各自酶活力，并计算热处理后的剩余酶活力，分析游离生姜蛋白酶和固定化生姜蛋白酶的热稳定性。

1.3.8 酶-无机杂化纳米花pH稳定性的测定

测定固定化和游离生姜蛋白酶在不同pH （2.0～10.0）条件下的酶活力，确定最适pH。再将两种酶分别置于不同pH的PBS缓冲液中处理2 h，检测各自酶活力，计算酸碱处理后剩余的酶活力，分析游离生姜蛋白酶和固定化生姜蛋白酶的pH稳定性。

1.3.9 纳米花重复率的测定[14]

测定收集好的纳米花的吸光度及酶活，并用去离子水重复洗涤测定后的纳米花，以去除纳米花表面残留的底物和产物，并测定纳米花的吸光度及酶活。

1.3.10 纳米花酶活的测定

通過煅烧法得到了纳米花的实际含酶量，称量一定量的纳米花，使其分散于2 mL PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）中，配制成均匀酶液，计算其稀释倍数并测其酶活。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线

由图1可知，酪氨酸标准曲线的R2=0.998 1，y=0.010 6x＋0.011 1，说明线性关系良好。

2.2 制备条件对酶-无机杂化纳米花形貌表征的影响

根据SEM（扫描电镜）分析不同条件下生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的形貌。

2.2.1 不同酶浓度对无机杂化纳米花的影响

由图2可知，在不同酶浓度下合成的纳米花紧密度和均匀性都不同，当生姜蛋白酶浓度为0.5 mg/mL时，纳米花花瓣的紧密程度最佳。当生姜蛋白酶浓度为0 mg/mL时，没有花状结构生成且相当破碎，可能是由于其生成的纳米材料中没有生姜蛋白酶。说明酶是生姜蛋白酶-无机杂化纳米花形成的必要条件，当溶液中没有酶时，就不能同溶液中的Cu 3（PO 4） 2·3H 2O形成生姜蛋白酶-Cu2＋络合物。

2.2.2 不同Cu2＋浓度对无机杂化纳米花的影响

由图3可知，随着Cu2＋浓度的增加，纳米花花瓣的排列更加紧密，外表也更加圆润。从纳米花外表上看，当Cu2＋浓度为0.8 mol/L时纳米花质量最好，当Cu2＋浓度升高到1.0 mol/L时，并没有出现形状规则均匀的纳米花，只出现了不规则形状的生姜蛋白酶-Cu2＋络合物，由此可知，当Cu2＋浓度过大时，会在一定程度上阻碍生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的形成。

2.2.3 不同pH值对无机杂化纳米花的影响

由图4可知，在溶液pH为6.0时，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花花瓣连接紧密，纳米花分布均匀，且粒径尺寸比较统一，在10 μm左右。但随着溶液pH的增加，纳米花花瓣结构逐渐破损且纳米花表面的孔隙在此条件下生长不完全。所以pH 6.0是生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的最佳孵育pH。当溶液pH过碱时，纳米花不能在溶液中稳定存在，可能是因为此时溶液的pH和生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的最适合pH相差较大，造成纳米花的形态差别较大。

2.2.4 不同温度对无机杂化纳米花的影响

由图5可知，当溶液放置在－20 ℃下孵育纳米花时，生成的生姜蛋白酶-Cu2＋络合物排列紧密，但从纳米花的微观形态上看，全是破碎的花瓣，表面结构不完整，几乎没有完整的纳米花。随着纳米花孵育温度增加到4 ℃，破损的纳米花花瓣结构转变为外表饱满、花瓣排列紧密的纳米花。随着温度的继续增加，纳米花花瓣又逐渐破损。由此可知，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的最佳孵育温度为4 ℃。

通过以上4个生姜蛋白酶-无机杂化纳米花最优孵育条件的测定，结合SEM对酶-无机杂化纳米花形貌的影响分析可以得出：生姜蛋白酶-无机杂化纳米花中最佳CuSO 4添加量为0.8 mol/L，最佳生姜蛋白酶浓度为0.5 mg/mL，最佳孵育温度为4 ℃，最佳孵育pH为6.0。

当酶浓度为0.5 mg/mL、CuSO 4浓度为0.8 mol/L、pH为6.0、温度为4 ℃时，测得生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的酶活力最高，可达10 302.2 U/mg，但预实验中测得生姜蛋白酶活力为138.143 U/mg，是游离生姜蛋白酶的7 000%，说明以生姜蛋白酶为有机成分、磷酸铜为无机成分，制备的酶-无机杂化纳米花的形貌结构与酶浓度、Cu2＋浓度、pH、温度等因素密切相关，纳米花外表圆润、花瓣饱满、形状规整、粒径相似时，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的酶活也更高。

2.3 制备条件对酶-无机杂化纳米花催化活性的表征

2.3.1 不同制备条件下纳米花的包埋率

2.3.1.1 蛋白质含量标曲的制备

由图6可知，蛋白质标准曲线线性方程为：y＝0.009 2x＋0.038 5，其中R2＝0.998 5，证明考马斯亮蓝标准曲线性良好，其中x为蛋白浓度，y为吸光值。

2.3.1.2 不同制备pH下的包埋率

不同制备pH下的包埋率见表1。

2.3.1.3 不同制备温度下的包埋率

不同制备温度下的包埋率见表2。

2.3.1.4 不同制备酶浓度下的包埋率

不同制备酶浓度下的包埋率见表3。

2.3.1.5 不同制备Cu2+浓度下的包埋率

不同制备Cu2＋浓度下的包埋率见表4。

利用各种不同生成条件下的纳米花测定其包埋率，由表3可知，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的包埋率在酶浓度为0.5～1.0 mg/mL范围内随酶浓度的增加而增加，但当酶浓度过大（2.0 mg/mL）时，包埋率不能继续增加，过多的酶并不能随着酶浓度的增加而被固定。由表1～表4可知，纳米花的包埋率随CuSO 4添加量、最佳孵育温度、最佳孵育pH的变化不显著。

2.3.2 不同制备条件下纳米花的酶活

2.3.2.1 不同制备酶浓度下的酶活

不同制备酶浓度下的酶活见表5。

通过对不同酶浓度下制成的生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的酶活进行检测，发现利用生姜蛋白酶浓度分别为0.5，1.0，2.0 mg/mL时，制备出的生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的平均酶活分别为10 138.7，7 639.4，3 044.8 U/mg。其中纳米花酶活最高的为初始生姜酶浓度在0.5 mg/mL时，而在相同条件下所测的游离生姜蛋白酶酶活为138 U/mg，通过计算可得酶浓度在0.5 mg/mL时孵育的纳米花的酶活是游离生姜蛋白酶的7 347%，而在初始生姜酶浓度为0.5 mg/mL时形成的纳米花花瓣的紧密程度也最佳，由此可以推断出，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的结构完整性和其酶活力有一定的关系。

2.3.2.2 不同制备Cu2+浓度下的酶活

不同制备Cu2＋浓度下的酶活见表6。

从纳米花外表看，当Cu2＋浓度为0.8 mol/L时纳米花质量最好。经过测定，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花酶活随着Cu2＋浓度的增加而增加，当Cu2＋浓度升高到0.8 mol/L时，纳米花酶活最高，平均达到13 506 U/mg。但是Cu2＋浓度继续增加，纳米花酶活又逐渐降低到4 390 U/mg左右。在图3中可以观察到Cu2＋浓度为1.0 mol/L时只出现了不规则形状的生姜蛋白酶-Cu2＋络合物。表明Cu2＋浓度对纳米花酶活有显著的影响，再次印证了纳米花的酶活力和其形态结构有一定的关系。

2.3.2.3 不同制备pH下的酶活

不同制备pH下的酶活见表7。

本实验选择6.0，8.0，10.0为孵育pH，经过计算得到在不同pH下孵育的生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的酶活，得出pH 6.0，8.0，10.0制备的生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的平均酶活分别为8 949.4，6 437.9，4 162.5 U/mg。可以看出纳米花的酶活随着制备pH的升高而降低。由图4可知，极端pH会对纳米花的合成及酶活产生一些不良的影响。

2.3.2.4 不同制备温度下的酶活

不同制备温度下的酶活见表8。

通过对不同孵育温度下生姜蛋白酶-无机杂化纳米花酶活进行检测，得到温度为－20，4，20 ℃下制备的生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的平均酶活分别为2 721.7，7 634.4，5 731.8 U/mg。发现在温度为－20 ℃时纳米花酶活极小，这时通过扫描电子显微镜观察并没有发现纳米花的存在，其形态上只呈现出破碎的花瓣状，其原因可能是在－20 ℃时Cu2＋与生姜蛋白酶不能通过不断的配位而交联生长。

2.3.3 不同制备酶浓度下纳米花的实际含酶量

纳米花质量变化见表9，不同酶浓度下实际含酶量见表10。

一定的高温条件可以去除纳米花中绝大多数的生姜蛋白酶（有机成分），留下的蓝绿色固体为Cu 3（PO 4） 2（无机成分），通过计算可以得出纳米花中的实际含酶量。由表10可知，在酶浓度为0.5，1.0，2.0 mg/mL时纳米花的实际含酶量平均为12.8%、21.2%、52.7%，在0.5～2.0  mg/mL酶浓度范围内，纳米花的酶含量随着酶浓度的增加而增加，但酶浓度过高会导致纳米花结构过于致密，造成物质传递受到阻碍，并不利于酶与底物相接触，可能还会导致酶活降低，与表5的研究结果一致。

2.4 酶-无机杂化纳米花pH稳定性分析

对纳米花的pH稳定性进行了探究，考察了等量固定化酶和游离酶在不同pH（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0）下处理2 h后的酶活。由图7可知，在不同pH下，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花和游离生姜蛋白酶表现出同样的趋势，酶活先上升，在pH 6.0时都达到最大值，随后pH上升，酶活随之下降。这表明生姜蛋白游离酶的固定化并没有改变生姜蛋白酶的最适pH。

2.5 酶-无机杂化纳米花的热稳定性

由图8可知，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花和游离生姜蛋白酶的最适温度皆为60 ℃，结果表明生姜蛋白游离酶的固定化并没有改变生姜蛋白酶的最适温度。当温度从60 ℃继续升高后，纳米花和游离酶酶活反而下降，说明温度过高会使蛋白酶高级结构被破坏，使酶变性失活。

2.6 酶-无机杂化纳米花的重复率

最后进行可重复性能研究，结果见图9。生姜蛋白酶-无机杂化纳米花第1次的相对酶活是100%，使用6次后其活性仍能维持初始值的30%，说明生姜蛋白酶纳米花材料重复使用性能良好。

3 结论

本实验以自制生姜蛋白酶作为有机成分，以磷酸铜作为无机成分，成功组装了生姜蛋白酶-磷酸铜杂化纳米花固定化材料，并详细研究了其制备条件、酶学性质，考察了纳米花形态与纳米花酶活之间的关系，发现在纳米花外表圆润、花瓣饱满、形状规整、粒径相似时，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的酶活更高。得到了生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的最佳制备条件：酶浓度为0.5 mg/mL，CuSO 4浓度为0.8 mol/L，pH为6.0，温度为4 ℃，此时酶活力最高，可达到10 302.2 U/mg，是游离生姜蛋白酶的7 000%。发现生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的酶活和其实际含酶量不成正比，生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的重复使用性较好，其温度和pH稳定性均有所提高。

参考文獻：

[1]周陆红，李萌，韩太利，等.生姜加工产品应用研究现状与前景展望[J].蔬菜，2021（1）：51-57.

[2]罗璇，陈常缘，王秀原，等.磁性复合载体固定生姜蛋白酶的酶学性质研究[J].中国调味品，2020，45（3）：57-61.

[3]柯彩霞，范艳利，苏枫，等.酶的固定化技术最新研究进展[J].生物工程学报，2018，34（2）：188-203.

[4]CEVAHIR A， CANAN G， ONUR A， et al. Evaluation of organic-inorganic hybrid nanoflower's enzymatic activity in the presence of different metal ions and organic solvents[J].International Journal of Biological Macromolecules，2020，164：162-171.

[5]李璟，楚楚，颜继忠.酶-无机杂化纳米花的制备及在药物研究中的应用进展[J].药物分析杂志，2021，41（1）：21-28.

[6]罗鹏.多酶杂化纳米花级联反应体系的构建及其在催化降解淀粉和纤维素中的应用研究[D].南京：江苏大学，2020.

[7]孟虹，赵怡，李宪臻，等.蔗糖异构酶Pal I-Cu2＋纳米花固定化酶的制备及其结构、性能分析[J].中国生物制品学杂志，2021，34（3）：286-289，293.

[8]GE J， LEI J， ZARE R N. Protein-inorganic hybrid nanoflowers[J].Nature Nanotechnology，2012（7）：428-432.

[9]罗璇，王秀原，钱静，等.磁性復合载体固定生姜蛋白酶的工艺优化研究[J].中国调味品，2019，44（11）：85-90.

[10]王翠丽，唐晓珍.生姜蛋白酶固定化研究[D].泰安：山东农业大学，2009.

[11]梁丽雯.利用组装方法制备木瓜蛋白酶-无机杂化纳米材料[D].大连：大连工业大学，2016.

[12]GL O T， OCSOY I. Preparation of magnetic horseradish peroxidase-laccase nanoflower for rapid and efficient dye degradation with dual mechanism and cyclic use[J].Materials Letters，2021，303：130501.

[13]李宁宁.酶-无机物复合纳米花的制备及催化合成精细化学品的研究[D].杭州：杭州师范大学，2020.

[14]李从海.脂肪酶-无机杂化纳米花的制备及其催化性能的研究[D].天津：天津科技大学，2020.