酿酒酵母筛选及乙醇发酵条件的优化

张玲玲 宋璐 孙京格 孟梦 侯丽华

摘要：能源危机导致人们将视野转移到可再生能源的开发与利用上，乙醇作为一种不含硫及灰分的清洁燃料，逐渐进入人们的视野并被用于替代汽油和柴油。人们对乙醇生产方式的研究越来越多，目前生产乙醇的重要手段是通过发酵技术，利用酵母对粮食或纤维类废弃物进行发酵，将其转化为生产燃料乙醇。近年来，国内鲜有对酿酒酵母菌株筛选并优化发酵条件的研究，该研究针对天津科技大学诱变的编号为H1～H17的17株酿酒酵母进行筛选，并对筛选出的4株优良酿酒酵母进行单因素试验和正交试验，获得最优发酵条件：YPD液体培养基初始还原糖浓度为220 g/L，接菌量为1×108 CFU/mL，不添加葡萄糖和添加6%的乙醇，在此条件下，发酵结束后残留还原糖含量最低，乙醇生成率最高。

关键词：能源危机；乙醇；酿酒酵母；正交试验；最优发酵条件

中图分类号：TS201.3      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）07-0056-05

Abstract： The energy crisis has led people to shift their vision to the development and utilization of renewable energy. As a clean fuel without sulfur or ash， ethanol has gradually entered people's vision and been used to replace gasoline and diesel.There are more and more researches on ethanol production methods. At present， an important way to produce ethanol is to use yeast to ferment and convert grain or fiber wastes into fuel ethanol through fermentation technology. In recent years， there are few studies on screening Saccharomyces cerevisiae strains and optimizing fermentation conditions in China. In this study， 17 strains of Saccharomyces cerevisiae numbered H1～H17 mutagenized by Tianjin University of Science and Technology are screened， and single facter test and orthogonal test are conducted on the four selected excellent Saccharomyces cerevisiae strains. The optimal fermentation conditions are obtained as follows： the initial reducing sugar concentration of YPD liquid medium is 220 g/L， the inoculation amount is 1×108 CFU/mL， without adding glucose and adding 6% ethanol， under these conditions， the residual reducing sugar content is the lowest and the production rate of ethanol is the highest after fermentation.

Key words： energy crisis; ethanol; Saccharomyces cerevisiae; orthogonal test; optimal fermentation conditions

隨着不可再生资源的逐渐枯竭及环境的日益恶化，资源紧缺和环境污染问题成为人们关注的焦点，人们逐渐将视野转移到可再生能源的开发与利用上，用其取代石油资源。乙醇是一种不含硫及灰分的清洁燃料，它的用途很广，可用于制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等，也被用于医疗消毒及国防工业、医疗卫生、有机合成、食品工业、工农业生产等领域[1]。用乙醇代替汽油、柴油，一方面，可减少原油的使用，节约资源且降低成本；另一方面，它在燃烧期间抑制颗粒和氮氧化合物以及其他温室气体的排放[2-3]，可减少汽车尾气对环境的污染，保护环境。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酒及发酵食品制作过程中不可或缺的辅料。乙醇生产过程中，在底料中添加酿酒酵母，酵母发酵利用底物代谢生成产物乙醇，之后将产物脱水并进行适当处理即可获得燃料乙醇。目前我国乙醇生产方式中以纤维素为代表的第2代乙醇发酵技术，主要存在秸秆收集处理效率低、预处理费用和纤维素酶成本高等问题[4-5]；以合成气生物发酵法生产乙醇的技术存在生产效率低、气体底物在液相中的溶解性差、传质性能不佳等问题[6]。因此，我国乙醇的主要生产方式为以玉米和木薯等粮食为原料的第1代生物发酵法，其中玉米发酵法占比为61%[7]。酿酒酵母还含多种生理活性物质和营养成分，将其添加至食品和动物饲料中，不仅能提高营养价值，而且具有保健功能，可调节肠道菌群，促进营养物质吸收，提高免疫功能和抗氧化功能，缓解应激[8]。此外，酿酒酵母与动植物同为真核生物，具有很多相同的细胞结构，并且具有繁殖快、代谢时间短、易于培养和分离等特点，因此，常用酿酒酵母作为食品科学研究中的实验生物[9]。筛选出优良的酿酒酵母菌种不仅能提高乙醇的产量和质量，提高生产效率，降低生产成本，而且能缓解能源危机，减轻环境污染。因此，对酿酒酵母进行筛选及乙醇发酵条件的优化具有重要的科研意义和经济价值。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

菌种：天津科技大学诱变选育的编号为H1～H17的17株酿酒酵母。

YPD培养基（yeast extract peptone dextrose，YPD）[10]：1%酵母膏，2%蛋白胨，1.5%琼脂粉，115 ℃高温灭菌20 min，添加5%的葡萄糖。

玉米培养基：玉米面经糖化后得到葡萄糖浓度为240 g/L的发酵培养基，添加0.05％的（NH 4） 2HPO 4 和0.05％的KH 2PO 4。

1.2 材料与试剂

玉米面：天津市滨海新区明耀超市；重铬酸鉀、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸（分析纯）：博欧特（天津）化工贸易有限公司；乳糖（分析纯）：天津市奥淇医科医药销售有限公司。

1.3 仪器与设备

微量离心机、冷冻大容量离心机、全波长酶标仪 美瑞泰克科技有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 检测还原糖含量的方法

参考《生物化学实验方法和技术》[11]中的DNS法，分两步进行测定，测量仪器为酶标仪：绘制还原糖标准曲线，分梯度配制葡萄糖溶液，加入DNS试剂，经过处理，在540 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线；样品测定：取合适稀释浓度的样品，用同样的方法处理并进行测定，根据第一步绘制出的标准曲线计算样品中的还原糖含量。

1.4.2 检测乙醇含量的方法

参考文献[12]，用重铬酸钾比色法分两步进行测定，测量仪器为酶标仪：绘制乙醇标准曲线，分梯度配制乙醇溶液，加入重铬酸钾溶液，经过处理后，在600 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线；样品测定：取合适稀释浓度的样品用同样的方法处理并进行测定，根据第一步绘制出的标准曲线计算样品中的乙醇含量。

1.4.3 检测海藻糖含量的方法

参考文献[13]，用蒽酮-硫酸法分两步进行测定，测量仪器为酶标仪：绘制标准曲线，分梯度配制海藻糖溶液，加入蒽酮-硫酸溶液，经过处理后，在630 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线；胞内海藻糖的提取与测定：用冰水提取酵母泥的胞内海藻糖，加入三氯乙酸，通过振荡离心的方法提取。通过标准曲线计算海藻糖含量。

1.5 分析方法

所有试验均重复3次以上，所列的数据均是3次独立试验的平均值。

2 结果与讨论

2.1 筛选优良酿酒酵母菌株

选取实验室诱变选育的17株酿酒酵母（编号为H1～H17）进行乙醇发酵，整个发酵过程中，间隔一段时间检测发酵溶液中剩余还原糖含量，检测结果见图1，初始还原糖浓度均为240 g/L，在发酵前25 h内，H1～H17菌株对还原糖的消耗均很快，每隔5 h残留还原糖的含量大幅锐减；在发酵25 h后，残留还原糖的含量递减速度变缓；在发酵72 h时，残留还原糖的含量基本接近于0，可认为72 h为发酵最长时间，设置72 h为本试验结束时间。对比不同菌株试验结束后溶液中残留的还原糖含量，编号为H1、H3、H6、H7、H17的菌株溶液中含量较少，分别为0.88，0.94，0.94，0.91，0.92 g/dL，可见在实验室诱变选育的17株酿酒酵母菌株中，上述5株菌株对还原糖的消耗较多，更能充分利用发酵醪液中的还原糖。

发酵结束时测定发酵醪液中乙醇的含量，测定结果见图2。

由图2可知，当发酵进行到72 h时，即发酵结束，编号为H1、H3、H7、H17菌株的溶液中产物生成量较高，乙醇含量分别达到9.42，8.50，8.31，9.08 g/dL。

判断酿酒酵母菌株是否优良主要看乙醇发酵过程中是否能消耗更多还原糖，生成更多乙醇。通过对17株酿酒酵母发酵过程中和结束时还原糖和乙醇含量的测定可知，H1、H3、H7、H17这4株为较优酿酒酵母菌株，并用于后续试验。

2.2 优化发酵条件

分别改变YPD液体培养基中葡萄糖含量、乙醇含量、初始还原糖浓度、酵母菌接菌量4个不同的发酵条件，将筛选出的4株优良菌株进行发酵试验。

2.2.1 葡萄糖含量对发酵结果的影响

发酵醪液中初始还原糖浓度为240 g/L，分别在YPD液体培养基中添加葡萄糖（0%、3%、6%、9%），发酵结果见图3。发酵醪液中残留的还原糖含量均低于2%，随着葡萄糖添加量的增加，残留的还原糖含量也有所增加，而每种菌株中不添加葡萄糖的培养基中还原糖残留量最少，分别为0.86，0.89，0.82，0.87 g/dL。发酵结束后测定培养基中的乙醇含量发现，乙醇含量均高于7 g/dL，随着葡萄糖添加量的增加，乙醇生成量有所降低，每种菌株中不添加葡萄糖的培养基中生成的乙醇含量最多，乙醇含量分别达到9.55，8.97，8.70，9.17 g/dL。结果表明，不添加葡萄糖的培养基在发酵过程中消耗还原糖最多，生成乙醇含量最高。

2.2.2 乙醇含量对发酵结果的影响

分别在YPD液体培养基中添加乙醇（0%、3%、6%、9%），结果见图4。发酵醪液中残留的还原糖含量均低于1.2%，每种菌株乙醇添加量为6%的培养基残留的还原糖含量最低，分别为0.84，0.85，0.92，0.82 g/dL。所有试验组发酵结束后乙醇含量均高于8 g/dL，当乙醇添加量在6%以内时，随着添加量的增加，乙醇生成量也逐渐增加，当乙醇添加量为9%时，乙醇含量有所降低。因此乙醇添加量为6%时，4种菌株在发酵过程中消耗更多还原糖，生成更多乙醇。

2.2.3 初始还原糖浓度对发酵结果的影响

分别改变发酵醪液中初始还原糖浓度（200，220，240，260，280 g/L），研究初始还原糖浓度对发酵结果的影响，结果见图5。残留的还原糖含量差别较大，当初始还原糖浓度为200，220，240 g/L时，发酵过程中消耗的还原糖含量较多，发酵结束时残留的还原糖含量基本都在1%以下，当初始还原糖浓度为260，280 g/L时，发酵过程中消耗的还原糖不多，结束时残留的还原糖含量仍较高，分别为1.53，2.15 g/dL，且发酵时间延长，约在80 h发酵结束。乙醇生成量结果见图5中b，乙醇生成量均高于8 g/dL，且初始还原糖浓度越高，乙醇的生成量就越多，为了确定最优初始还原糖浓度，还需要通过乙醇实际与理论产率比来进行比较。

由表1可知，当初始还原糖浓度低于220 g/L时，随着初始还原糖浓度的升高，乙醇实际与理论产率比有所提高，当初始还原糖浓度高于220 g/L时，乙醇的生成量有所增加，但乙醇实际与理论产率比逐渐下降，表明对原料的利用率降低，而且发酵时间延长，考虑到对原料的利用率及时间成本，选择初始还原糖浓度为220 g/L。

2.2.4 酵母菌接菌量对发酵结果的影响

分别改变发酵醪液中的接菌量（1×107，2×107，1×108，2×108 CFU/mL）验证酵母菌接菌量对发酵结果的影响，结果见图6。发酵醪液中残留还原糖含量均低于1%，4种菌株中，接菌量为 1×108 CFU/mL的培养基残留还原糖含量最低，分别为0.82，0.90，0.91，0.86 g/dL，表明发酵过程中对还原糖的消耗最多。发酵结束时的乙醇含量见图6中b，所有试验组乙醇含量均高于8.4 g/dL，而接菌量为1×108 CFU/mL的试验组生成的乙醇量最高，4株菌的乙醇生成量分别达到9.71，9.31，9.26，9.57 g/dL。比较可知接菌量为1×108 CFU/mL时，最终残留还原糖含量最少，乙醇生成量最多，发酵最彻底。

随着乙醇发酵时间的延长，发酵醪液中乙醇的浓度越来越高，发酵醪液中的渗透压增加，不利于酿酒酵母的存活，而细胞内的海藻糖能够有效缓释溶液中的渗透压，甚至在恶劣环境中，能够调整细胞中海藻糖的含量来抵御外界对细胞的伤害。因此，细胞中海藻糖含量越高，对活性干酵母的制备越有利。测定4个菌种不同接菌量培养基的细胞内海藻糖含量，结果见图7。每个菌种细胞内海藻糖数量随着接菌量的增加呈递增趋势，当接菌量为 1×108 CFU/mL时达到最高峰，之后随着接菌量的增加又呈下降趋势，结合图6中接菌量对发酵影响的结果可知，当接菌量为 1×108 CFU/mL时，溶液中残留还原糖含量最少，乙醇生成量最多，可见海藻糖含量高，细胞活性强，发酵产物多。

2.2.5 正交优化条件

由上述4个单因素试验得出每种变量下的最优条件，但没有考虑各个因素的交互作用，因此按照表2的因素水平表进行四因素三水平的正交试验，得出发酵的最优条件。

由表3可知，通过极差分析，因素C（初始还原糖浓度）的变化对乙醇的生成率有较大影响，因素D（接菌量）次之，影响最小的是因素B（YPD中乙醇添加量）。所以各因素的主次顺序为C＞D＞A＞B，最优组合为A 1B 3C 2D 3，即最优发酵条件为YPD液体培养基初始还原糖浓度220 g/L，接菌量1×108 CFU/mL，不添加葡萄糖和添加6%的乙醇。

3 结论

本研究对乙醇发酵条件进行优化，首先筛选天津科技大学诱变的编号为H1～H17的17株酿酒酵母，通过对发酵结束后17株酿酒酵母的培养液中残留还原糖含量和乙醇含量进行比较，发现编号为H1、H3、H7、H17 4株酿酒酵母接入的发酵样品中最终残留还原糖量较低，乙醇含量较高。说明这4株酿酒酵母拥有较好的发酵能力，可以消耗更多底物，生成更多产物。其次对这4株优良酿酒酵母在单因素试验的基础上进行正交试验，获得最优发酵条件为YPD液体培养基初始还原糖浓度220 g/L，接菌量1×108 CFU/mL，不添加葡萄糖和添加6%的乙醇，在此条件下，发酵结束后残留还原糖含量最低，乙醇生成率最高。

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