青龙衣抗氧化应激作用机制的网络药理学研究

满红岩,崔新刚,孙 雪,沈广志

(牡丹江医学院 1.药学院;2.公共卫生学院,黑龙江 牡丹江 157011)

青龙衣是胡桃科胡桃属植物胡桃楸未成熟果实的干燥果皮,化学成分复杂,具有抗氧化应激、抗肿瘤、消炎镇痛、抗菌等生物活性[1-6]。青龙衣黄酮类化合物在抗氧化应激方面起到一定的作用,目前对其相应的作用机制尚未进行深入研究。氧化应激是指体内活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)的生成与抗氧化酶系统清除ROS能力的平衡被打破,引起机体的氧化损伤。研究发现,氧化应激导致生物膜损伤和蛋白降解或自噬/溶酶体途径的失调,导致人体细胞、组织的氧化损伤,与机体衰老、神经退行性疾病等的发生有密切关系[7-8]。该文利用网络药理学方法对青龙衣黄酮类化合物抗氧化应激作用的活性成分、作用靶点、信号通路等进行系统分析,为青龙衣的进一步研究及利用提供参考。

1 资料与方法

1.1 活性成分及作用靶点筛选利用中国知网、万方、PubMed等数据库收集青龙衣黄酮类化合物成分,通过PubChem数据库对收集到的成分进行结构确认,并将其结构式保存为sdf格式。将上述青龙衣黄酮类化合物sdf格式上传到SwissADME数据库(http://swissadme.ch/),设置种属为“homo sapiens”,依据胃肠道吸收、类药性等指数对成分进行筛选,将筛选后得到的成分sdf格式逐一导入SwissTargetPrediction数据库进行靶点收集,并将所得靶点去重整合。

1.2 抗氧化应激靶点筛选通过GeneCards数据库、OMIM数据库查询抗氧化应激相关靶点。利用微生信在线数据分析平台绘制韦恩图,从而获得成分和抗氧化应激的交集靶点。

1.3 “药物-成分-靶点”网络构建与分析利用CytoScape 3.7.1软件构建青龙衣“药物-成分-靶点”网络,通过CytoScape 3.7.1软件中NetworkAnalyzer方法对网络进行拓扑参数分析,收集主要活性成分及靶点的度值(degree)信息。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建及关键靶点筛选将药物-疾病交集靶点导入STRING数据库,设置物种为 “homo sapiens”,“minimum required interaction score”设置中选择highest confidence(0.700),隐藏游离节点(Node)后,得到PPI相互作用关系网络,将结果保存为TSV文件。利用CytoScape 3.7.1软件对TSV文件进行参数分析,运用cytoHubba插件,根据MCC筛选出排名前十的为关键靶点。

1.5 GO和KEGG富集分析选择获取的关键靶点导入DAVID 6.8数据库,限定物种为“Homo sapiens”,进行GO功能富集和KEGG通路分析,将结果导入Omicshare在线平台进行可视化分析。

2 结果

2.1 活性成分筛选及潜在靶点的筛选检索出66个青龙衣黄酮类化合物,根据筛选标准纳入有效活性成分32个。同时,通过SwissTargetPrediction数据库对活性成分进行靶点预测,去除重复靶点,得到430个成分潜在作用靶点。利用OMIM数据库、GeneCards数据库检索获得抗氧化应激的相关靶点,去除重复后筛选得到抗氧化应激靶点4 186个。通过韦恩在线平台,对药物和疾病的靶点取交集,获得青龙衣黄酮类化合物发挥抗氧化应激作用的“药物-疾病”交集靶点306个,见图1。

2.2 “药物-成分-靶点”网络分析将维恩分析获得药物与疾病的交集靶点导入CytoScape 3.7.1软件中,得到“药物-成分-靶点”网络,见图2。经网络图分析,筛选出度值较高的活性成分有柚皮素、球松素、黄芩素、黄卡瓦胡椒素A、异泽兰黄素等。

图1 青龙衣黄酮类成分靶点(A)与抗氧化应激相关靶点(B)的Veen交集图

图2 药物-成分-靶点网络图

2.3 PPI网络图构建与分析将交集靶点导入STRING 11.0数据库,输出蛋白质相互作用网络图,导入CytoScape 3.7.1软件分析得到排名前十的关键靶点,见图3。其中,degree值排名在前列的关键靶点为EGFR、MAPK1、STAT3、AKT1等。

图3 PPI网络图

2.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析利用David数据库对抗氧化应激的交集靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集(P<0.05)分析。GO功能注释分析包括生物途径(Biology Process,BP),细胞定位(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF),BP富集出756条条目,CC富集出100条条目,MF富集出213条条目,主要涉及的生物过程包括蛋白质自动磷酸化、氧化还原过程、细胞蛋白质代谢过程、凋亡过程的负调控等;细胞组成相关富集主要过程有细胞溶质、细胞膜、细胞外间隙、细胞表面等;分子功能相关的富集过程主要涉及ATP结合、酶结合、蛋白激酶活性、一氧化氮合酶调节剂活性等,见图4。

图4 GO功能富集分析

KEGG通路分析获得172条通路,主要涉及肿瘤信号通路、PI3K/AKT信号通路、雌激素信号通路、花生四烯酸代谢信号通路、Ras信号通路等,见图5。

图5 KEGG通路富集分析

3 讨论

网络药理学分析青龙衣抗氧化应激的关键成分包括柚皮素、球松素、黄芩素、异泽兰黄素等。柚皮素具有抗炎和抗氧化应激活性,其对氧化应激诱导的成骨细胞凋亡具有拮抗作用[9],可降低糖尿病视网膜病变大鼠的氧化应激损伤[10],通过影响氧化应激途径改善阿尔兹海默病模型大鼠的学习记忆能力[11]。黄芩素可改善氧化应激状态下黑素细胞的线粒体形态和功能障碍。异泽兰黄素具有保护正常组织细胞免受氧化损伤的作用[12]。

PPI分析可知,青龙衣黄酮类成分抗氧化应激的关键靶点主要有EGFR、MAPK1、STAT3、AKT1等。EGFR介导的氧化应激所致的AKT磷酸化弱化了硼替佐米促肝癌细胞凋亡效应[13]。MAPK是参与介导细胞生长、分裂、分化、死亡以及细胞间的功能同步等生理过程的信号转导系统之一[14],抑制MAPK信号通路,可抑制细胞凋亡,保护肾脏[15]。STAT3是STAT蛋白家族中一种重要的核转录因子,在细胞外信号的刺激下参与调节细胞增殖、分化、凋亡和自噬[16]。氧化应激可诱导小鼠睾丸组织p-STAT3蛋白表达水平升高,促进细胞凋亡[17]。

通过KEGG通路富集分析发现,核心靶标涉及的主要通路有PI3K/AKT信号通路、雌激素信号通路、Ras信号通路等。PI3K/Akt通路与氧化应激反应关系密切,激活PI3K/AKT通路可以抑制机体组织的氧化应激、炎症和细胞凋亡[18-19],PI3K/AKT可能通过靶向介导Nrf2信号通路影响氧化应激[20]。抑制高糖诱导的氧化应激反应及PI3K/AKT通路活化可减少炎症因子产生[21]。PI3K/AKT信号通路的激活还可促进GSK3β的磷酸化,抑制线粒体MPTP开放,从而减轻氧化应激[22]。雌激素与细胞膜上的雌激素受体(ER)结合可激活PI3K信号通路,其也可与G-蛋白偶联受体(GPR30)结合,激活PI3K、MAPK信号通路[23]。HIF-1α和VEGF共同参与心肌细胞氧化应激过程,核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶1(HO-1)/HIF-1α/Autophagy信号通路被激活,可促进心肌细胞抗氧化应激[24]。HIF-1α的高表达可通过调节其下游靶基因RBM45和ASB15降低氧化应激,可以减轻苯致小鼠造血系统的损伤[25]。

综上所述,本文基于网络药理学方法以青龙衣黄酮类化合物为研究对象,对其抗氧化应激的成分,作用靶点,相关生物过程及通路进行分析,发现柚皮素、球松素、黄芩素等主要成分,EGFR、MAPK1、STAT3、AKT1等关键靶点及肿瘤信号通路、PI3K/AKT信号通路、雌激素信号通路等关键信号通路,为青龙衣抗氧化应激研究提供一定的参考和启示,但受限于数据库的时效性、完整性及体内环境影响等条件,青龙衣抗氧化应激机制的研究尚未完全清楚,仍有待于进一步的实验验证。