C端带Flag标签重组小鼠IL-33慢病毒载体的构建及鉴定

高二可,张 路,徐旺旺,金齐力

(1.蚌埠医学院;2.蚌埠医学院第二附属医院,安徽 蚌埠 233004)

IL-33在1999年首次被鉴定为在犬动脉中表达的DVS27蛋白[1]。它在2005年被再次发现并鉴定为IL-1家族成员,表达于人类和小鼠的多个器官和细胞类型中[2],是抑制致瘤性受体(ST2)的配体。IL-33与其配体ST2结合后通过MyD88/IRAK4信号复合体转导信号,激活下游NF-κB等多种转录因子发挥作用[3]。已有研究表明IL-33能有效刺激肥大细胞、自然杀伤细胞(NK)、固有淋巴细胞(ILCs)、Th1细胞、CD8+T细胞和调节性T细胞(Treg)[4]。IL-33/ST2信号被证明在一些组织的炎症性疾病和伤口愈合反应中能有效激活Th2免疫反应,并与许多炎症性和过敏性疾病相关,包括类风湿关节炎、哮喘等[5-6]。尽管有很多研究证明IL-33/ST2信号通路在多种炎症中发挥作用,但是很少有人研究该通路是如何导致癌症的。因此,我们克隆小鼠IL-33基因,构建C端带Flag标签的重组小鼠IL-33慢病毒载体,目的为进一步探究IL-33在肿瘤免疫中的作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 KOD酶、dNTP、MgSO4(toyobo);琼脂糖(圣尔生物);DNA凝胶回收试剂盒、DNA上样缓冲液、DNA Marker 100bp ladder、琼脂粉(碧云天公司);限制性核酸内切酶ApaI和XhoI (NEB公司);T4DNA连接酶(赛默飞公司);Plasmid Extraction MiNi Kit(toroivd);大肠杆菌DH5α感受态细胞(天根公司);酵母粉(OXOID);氨苄青霉素(Biosharp公司);引物(上海华津);pLVX-puro慢病毒载体(本实验室提供);Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(翌圣生物);BABL/c小鼠(购买于河南斯克贝斯实验动物中心)。

1.1.2 引物 从NCBI 数据库中的GenBank中查找到小鼠IL-33基因CCDS序列,利用snapgene软件设计引物。根据慢病毒载体pLVX-puro多克隆位点的限制性核酸内切酶,在上游引物的5’端加上限制性核酸内切酶Xhol识别序列和保护碱基,序列为:上游引物Forward primer,5’-CCG CTCGAG ATGAGACCTAGAATGAAG(黄色标识部分为内切酶Xhol识别位点);在下游引物的5’端加上限制性核酸内切酶Apal识别序列、保护碱基以及Flag标签序列,序列为:下游引物Reverse primer,5’-TCC GGGCCC TTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC GATTTTCGAGAGCTTAAAC(黄色标识部分为内切酶Apal识别位点,划横线部分为Flag标签序列)。引物设计完成后由上海华津生物公司合成。

1.1.3 主要仪器 DNA 电泳槽、凝胶电泳显像仪和PCR仪(Bio-rad公司);细菌培养箱(上海一恒仪器公司);振荡器(上海智诚生物仪器公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾脏RNA的获取和RT-PCR BABL/c小鼠脱颈处死,经消毒后无菌取出脾脏,加入trizol后经匀浆机裂解成匀浆,12 000 rpm离心5 min留取上清液,氯仿-异丙醇提取总RNA。将总RNA与Mix混合,在42 ℃孵育以去除残留基因组DNA。再以此RNA为逆转录模板,Oligo(dT)18为引物,在20 μL体系里逆转录获得cDNA。

1.2.2 小鼠IL-33-Flag目的基因的扩增及琼脂糖凝胶电泳 以cDNA为PCR模板,扩增目的基因。配制PCR反应体系如下:cDNA模板1 μL,上、下游引物各1 μL,10×缓冲液5 μL,dNTP 5 μL,MgSO4 3 μL,KOD酶1 μL,双蒸水33 μL。PCR仪设置程序如下:预变性94 ℃(反应5 min),变性94 ℃(反应30 s)、退火55 ℃(反应30 s)、延伸72 ℃(反应30 s),此过程循环38次。最后72 ℃再延伸(反应10 min),4 ℃终止反应。取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,时间30 min,在凝胶电泳显像仪里拍照,查看结果。

1.2.3 小鼠IL-33-Flag基因接入pLVX-puro慢病毒载体和菌落PCR鉴定 PCR产物按照DNA凝胶回收试剂盒操作说明书,进行直接回收纯化。在30 ℃条件下,利用限制酶Apal和Xhol双酶切回收产物1 h。酶切后的目的基因进行1%琼脂糖电泳,时间为30 min,再切下目的片段回收。pLVX-puro慢病毒载体的双酶切方法是相同的。在22 ℃(PCR仪)条件下,用T4 DNA连接酶将酶切目的片段连入线性化慢病毒载体,连接1 h。使用热激法将10 μL连接产物导入DH5α感受态中,用50 μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板筛选出抗性菌落。在平板上挑4-5个生长菌落做菌落PCR鉴定,反应条件同上述PCR反应。菌落PCR反应后的产物进行琼脂糖电泳,时间30 min,在凝胶电泳显像仪里拍照,查看结果。

1.2.4 重组pLVX-Flag-mIL-33慢病毒载体的构建以及双酶切鉴定和目的基因测序 在4 mL 50 μg/mL的氨苄青霉素抗性LB培养基中加入经菌落PCR鉴定正确的菌液,37 ℃ 220 rpm摇菌过夜。选择浑浊的抗性菌液提取重组质粒。采用双酶切的方法鉴定重组质粒,配制如下体系:缓冲液2 μL,重组质粒17 μL,限制酶Apal和Xhol均为0.5 μL。酶切反应条件同上。双酶切后的重组质粒进行1%琼脂糖凝胶电泳,时间为30 min,在凝胶电泳显像仪上查看结果。最后将双酶切条带大小正确的的重组质粒送往上海华津生物公司测序。

2 结果

2.1 PCR扩增小鼠IL-33基因PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳显示出一条单一的大致为825 bp的目的片段,与预期结果一致,见图1。

图1 小鼠Flag-IL-33凝胶电泳图

2.2 pLVX-puro慢病毒载体线性化和菌落PCR鉴定限制性核酸内切酶Apal和Xhol双酶切pLVX-puro慢病毒载体,使其线性化,线性化质粒电泳速度比原质粒速度快。电泳图见图2。在氨苄抗性LB平板上挑选4个生长菌落做PCR鉴定,有3个可能是阳性结果。PCR产物电泳图见图3。

图2 双酶切pLVX-puro慢病毒载体电泳图

图3 菌落PCR产物电泳图

2.3 pLVX-Flag-mIL-33重组质粒双酶切及测序鉴定1号、3号、4号菌液37 ℃过夜培养后,挑选LB液体培养基浑浊的3号菌液进行提质粒。将3号质粒进行双酶切,电泳结果呈现两条大致为8102 bp和825 bp的目的条带,符合预期的结果。电泳图见图4。3号质粒标记好送公司测序,测得序列经过比对完全正确。测序结果见图5。

图4 pLVX-Flag-mIL-33重组质粒双酶切图

图5 测序结果图

3 讨论

IL-33是炎症和组织稳态的一个重要调节因子,其IL-33/ST2信号轴主要与免疫和免疫相关疾病有关[7]。据报道,IL-33/ST2轴会影响乙肝病毒感染后Th1和Th2细胞因子的产生[8]。此外,有研究表明哮喘患者血清IL-33显著升高,并与创伤性脑损伤的炎症,严重程度和预后有关[9-10]。最近,IL-33的生物学作用及其在恶性肿瘤中的作用越来越引起关注。细胞因子作为重要的媒介,支持肿瘤和肿瘤微环境中免疫细胞之间的信号传递[11]。细胞因子IL-33 参与了多种肿瘤的发生和发展,IL-33可以通过活化巨噬细胞以促进胃癌的发展[12],通过增加肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)的浸润促进胶质瘤的生长[13],而肿瘤中IL-33的缺乏会使调节性T细胞(Treg)被重新编程以上调IFN-γ的表达,在活体中促进肿瘤的消退[14]。与此一致的是,Sachiko[15]等人研究也表明IL-33在重塑TAM 方面发挥重要作用。由此可见,IL-33/ST2信号参与了炎症性TAM 调控,有望成为肿瘤早期诊断和预后的新指标以及治疗肿瘤的新靶点。然而在一些研究中,IL-33在肿瘤中表现出完全相反的作用,抑制肿瘤生长[16]。因此,IL-33在肿瘤免疫微环境中发挥的作用机制仍需进一步研究。

IL-33/ST2信号通路在肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中存在的这种相互矛盾的作用很大程度上是由于IL-33靶向细胞在TME 中的功能活动引起的。IL-33调控的肿瘤免疫治疗很可能是与其下游信号通路相关,而与癌症类型无关。

综上所述,本实验成功构建带Flag标签的重组小鼠IL-33慢病毒载体。其C端带有的Flag标签既有利于后续Western blot检测IL-33蛋白的表达,又不会影响IL-33在靶细胞内转录、翻译和修饰发挥作用,是后续在肿瘤中研究IL-33功能的一个很好的桥梁。因此,本实验选取慢病毒作为运载工具,将带标签的基因克隆到该载体上,为进一步研究IL-33在肿瘤免疫中的下游信号传递以及免疫参数奠定了基础。