TM4SF1对结直肠癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

盖欣欣,矫 健,杨恩帅,董 哲,郭素芬

(1.牡丹江医学院病理教研室;2.黑龙江省肿瘤疾病防治重点实验室,黑龙江 牡丹江 157011)

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)约占全部结直肠恶性肿瘤的95%,是全球常见的恶性肿瘤之一,发病率逐年增高[1]。CRC是肠黏膜上皮和腺体发生的恶性肿瘤,临床表现通常起病隐匿,早期症状可能仅见粪便隐血阳性,出现严重并发症常常见于晚期。CRC的治疗主要是手术、化学治疗、放射线治疗,但是手术适用于癌症早期,放、化疗的副反应大,耐药性高,复发率也高[2]。对于晚期CRC患者来说,放化疗效果不理想,尽管临床综合治疗可以延长部分患者的生存期,但有转移的CRC患者预后仍然很差,死亡率很高。积极寻找新的高效的治疗方法显得尤为迫切,并具有重要的临床价值[3]。因此,了解CRC发生、发展机制及确定潜在治疗靶点对于改善CRC患者预后是非常必要的。

四次跨膜蛋白L6家族成员1(Transmembrane-4 L-six family member-1,TM4SF1)是L6家族成员[4],其特征是四个高度保守的结构域、两个胞外环和一个小的胞内环[5-6],其最初被定义为具有某些四跨膜蛋白功能的肿瘤相关抗原,包括稳定细胞信号复合物以及在细胞增殖、粘附和运动中的作用[7]。作为关键的信号转导蛋白调节肿瘤细胞行为,并参与肿瘤的进展和迁移。研究证实,TM4SF1在多种上皮癌细胞中高表达,包括胰腺癌[8]、肝癌[9]、肺癌和膀胱癌[10]等。因此本研究选择CRC细胞SW1116为研究对象,旨在探讨TM4SF1对SW1116细胞增殖、迁移及凋亡的影响,以期为CRC治疗提供新的分子靶点和思路。

1 实验材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂CRC细胞SW1116购自武汉普诺赛生命科技有限公司;RPMI 1640培养基和胎牛血清购自GIBCO公司;mRNA提取试剂盒购自美国Omega公司;逆转录试剂盒购自美国Thermo公司;CCK-8试剂盒购于上海尚宝生物科技有限公司;GAPDH引物由上海生工设计完成;Transwell板购自Corning incorporated公司;TM4SF1 siRNA质粒、si-NC质粒、si-RNA转染试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 从TCGA数据库(http://gdc.cancer.gov)中下载TCGA-COAD/READ基因表达水平数据,通过Wilcoxon检验对结直肠癌组织和正常组织中的TM4SF1 mRNA表达进行分析。

1.2.2 细胞培养及细胞转染 将SW1116细胞培养在RPMI 1640完全培养基(RPMI 1640培养基和胎牛血清按9∶1比例配置RPMI 1640完全培养基,另加入1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)中,在37 ℃、5%CO2条件下培养。取对数期的SW1116细胞分为三组,即对照组(未进行转染处理)、NC组(加入si-NC质粒)、si-TM4SF1组(加入TM4SF1-siRNA质粒)。在转染前1 d,对细胞株进行传代,且更换为无双抗培养基,进行细胞计数后均匀接种于6孔板中培养,待细胞汇合度约70%时,再行细胞转染。按照转染说明书进行转染,对照组细胞未转染。将6孔板置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中,24 h后收集细胞进行后续实验。

1.2.3 qRT-PCR检测 使用RNA提取试剂盒从上述分组细胞中分离总RNA,测定RNA的浓度及纯度后,根据制造商的说明使用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。利用Fast SYBRgreen PCR master mix(Roche)通过引物序列进行扩增。反应条件如下:总反应体系20 μL,95 ℃预变性10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸10 min,进行40个循环。使用7500实时荧光定量PCR系统进行定量PCR(qPCR)检测。使用Δ阈值循环(2[-ΔΔCt])方法计算各组TM4SF1、GAPDH的相对表达水平,以检验转染效果。用于PCR扩增的引物序列如下:

GAPDH-F TCGTGGAAGGACTCATGACC

GAPDH-R TCCACCACCCTGTTGCTGTA

TM4SF1-F GCAAACGATGTGCGATGCTT

TM4SF1-R TTCTGCTAAGCCAAGGGCTG

1.2.4 CCK-8实验检测细胞增殖能力 取对数生长期的SW1116细胞分成3组,即对照组、NC组、si-TM4SF1组,用胰蛋白酶消化后接种于96孔板上,于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育,培养48 h后每孔加入10 μLCCK-8溶液,设置对照孔,放回恒温培养箱中继续培养,2 h后用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值。

1.2.5 Transwel实验检测细胞迁移能力 取结晶紫0.05 g溶于甲醇制成0.5%的结晶紫溶液,用时用PBS溶液1∶5稀释成0.1%的结晶紫染液。将经转染后的SW1116细胞用胰酶消化于1 500 rpm离心5 min,弃上清,无血清培养基重悬后计数。取灭菌的EP管,用200 μL的无血清培养基分别配制成含有2×104个的细胞悬液。将上述制备的细胞悬液,吹打均匀后加入Transwell小室中。Transwell板中加入500 μL含10% FBS的完全培养基,将小室放入板中。37 ℃下于CO2(含量5%)培养箱中培养24 h。将小室取出,用PBS洗去培养基,结晶紫染色10 min;自来水将表面的结晶紫洗除干净,用棉签将上室中的细胞擦除干净,于倒置显微镜下对非细胞接种侧拍照。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集上清:收集培养液于EP管中(有少量悬浮细胞)。收集细胞:六孔板中的细胞用PBS洗涤一次,加入1 mL 0.25%胰酶消化细胞,待细胞变圆且有部分细胞悬浮,即加入培养基终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞,使细胞悬浮。收集于EP管中,1 500 rpm离心5 min,弃上清。PBS洗涤细胞:加入3 mL 4 ℃预冷的PBS完全重悬细胞,1 500 rpm离心5 min,弃上清。沉淀用500 μL的Binding Buffer重悬。荧光标记:加入5 μL Annexin V-FITC和加入10 μL Propidium Iodide,混匀,室温下避光反应。于1 h内上机检测:Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL 1)检测,PI红色荧光通过PI通道(FL2)检测。流式细胞仪参数如下:激发波长Ex=488 nm,发射波长Em=530 nm。

1.3 统计学分析应用GraphPad Prism 8.0统计软件,计量资料以“均数±标准差”表示,采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据库显示TM4SF1在结直肠癌组织和正常组织中差异性表达通过TCGA下载TCGA-COAD/READ基因表达水平数据分析625个结直肠癌样本和51个正常样本发现,与正常结直肠组织相比,结直肠癌组织中TM4SF1表达显著增高,差异具有统计学意义(P<0.01,图1)。

图1 TCGA数据库分析结直肠癌组织和正常结直肠组织中TM4SF1 mRNA表达情况

2.2 TM4SF1-siRNA转染后SW1116细胞中TM4SF1 mRNA表达明显减低通过qRT-PCR检测,结果显示,成功转染TM4SF1-siRNA的SW1116细胞,TM4SF1 mRNA的表达水平比NC组降低(P<0.01,见图2),提示转染成功。其中si-TM4SF1 002组TM4SF1 mRNA表达水平最低,转染效率最高,用于后续实验。

图2 qRT-PCR实验检测下调TM4SF1后SW1116细胞中mRNA的表达情况

2.3 TM4SF1-siRNA转染后SW1116细胞增殖能力降低为了研究TM4SF1对CRC细胞增殖能力的影响,采用CCK-8实验检结果显示,作用48 h后,与NC组对比,si-TM4SF1组细胞增殖能力减低(P<0.01,见图3),这表明下调TM4SF1可以明显抑制SW1116细胞增殖能力。

图3 CCK-8实验检测下调TM4SF1后结直肠癌SW1116细胞增殖能力

2.4 TM4SF1-siRNA转染后SW1116细胞迁移能力降低为了检测下调TM4SF1对SW1116细胞迁移能力的影响,采用Transwell迁移实验,结果显示,与NC组比较,下调TM4SF1能够减少迁移的SW1116细胞数量,抑制细胞迁移能力(P<0.01,见图4)。

图4 下调TM4SF1后结直肠癌SW1116细胞迁移能力情况

2.5 TM4SF1-siRNA对SW1116细胞凋亡的影响为了检测下调TM4SF1对结直肠癌细胞凋亡影响,采用流式细胞术检测,结果发现与对照组、NC组相比,si-TM4SF1组SW1116细胞凋亡数量增加,表明下调TM4SF1后促进SW1116细胞凋亡(P<0.01,见图5)。

图5 下调TM4SF1对SW1116细胞凋亡的影响

3 讨论

CRC是最常见的消化系统恶性肿瘤,也是全世界男性癌症死亡主要原因之一。尽管手术切除癌症病灶取得良好临床疗效,但5年中位生存期仅不到70%。在人体内已经发现了至少34个TM4SF家族成员,它们在胚胎发育、细胞迁移、黏附中起重要作用。有研究证实,TM4SF1在上皮卵巢癌组织中表达增高,随着上皮性卵巢癌FIGO分期增加,TM4SF1蛋白表达水平也增加,表明其可能参与卵巢癌的发生和发展[11]。在肺癌中,TM4SF1高表达提示预后不良,促进肺癌细胞侵袭和迁移[12]。有研究表明,在乳腺癌中,沉默TM4SF1抑制乳腺癌细胞迁移、促进乳腺癌细胞凋亡[13]。因此,在CRC中,TM4SF1能否对结直肠癌细胞增殖、迁移及凋亡产生影响将是本研究的重点。

在过往研究中,TM4SF1在许多癌症中表达增高,且高表达往往提示预后不良。本研究首先通过TCGA数据库去验证TM4SF1在结直肠癌中表达,发现与正常结肠组织相比,TM4SF1在结直肠癌组织中的表达显著升高。本研究结果显示,通过qRT-PCR技术,将TM4SF1-siRNA转染至SW1116细胞,观察到与对照组及NC组相比,下调TM4SF1的mRNA水平明显减低(P<0.01),证明转染成功;在功能学实验中,运用瞬时转染方法构建干扰TM4SF1细胞株SW1116,采用CCK-8实验检测TM4SF1对细胞增殖能力的影响,结果显示,siRNA-TM4SF1组结直肠癌细胞增殖能力明显低于NC组,这说明TM4SF1可以促进结直肠癌细胞增殖;接着采用Transwell实验,检测了干扰TM4SF1对结直肠癌细胞迁移能力的影响,结果提示干扰TM4SF1可以抑制结直肠癌细胞SW1116的迁移能力。肿瘤的生长和侵袭性还取决于抗凋亡和促进凋亡因子之间的比例及与肿瘤细胞增殖活性的平衡。本研究采用流式细胞术,检测干扰TM4SF1对结直肠癌凋亡的影响,结果显示,与NC组对比,干扰TM4SF1促进结直肠癌细胞凋亡。上述研究结果提示TM4SF1参与了结直肠癌的发生、发展,与他人的研究结果有一致性。

综上所述,TM4SF1可以对结直肠癌SW1116细胞的增殖、迁移及凋亡能力产生影响。可以为研究TM4SF1对CRC细胞的增殖、迁移和凋亡方面的具体机制提供了新的实验依据。