压榨时间和方式对面神经压榨伤大鼠模型稳定性的影响

席梦含,封秀梅,黄 辰,王 路,姚俊鹏,张 微

(成都中医药大学针灸推拿学院,四川 成都 610075)

周围性面瘫是临床常见病、多发病,每年的发病率约11.5～53.3/10万人[1]。其临床表现为口眼斜、眼裂扩大等,轻则影响患者面部功能活动,甚则引发心理障碍,妨碍患者常规工作与日常社交[2-3]。近年,临床试验证实针灸治疗周围性面瘫确切有效[4-5],但其相关机制需要进一步的研究。为深入研究该作用机制,开展相关动物实验是十分必要的,其中最重要的任务是建立与人类疾病相同发病机制的动物模型[4]。周围性面瘫的关键致病位点是面神经,其压榨法作为观察面神经损伤生理病理变化或再生修复研究的方法被广泛应用[6]。但是,通过初步检索,我们发现各研究之间在压榨方法和时间上各不相同[5]。故为了建立稳定的面神经压榨伤模型,本研究以大鼠为载体,选择常用三个不同面神经压榨时间和四种压榨方法,欲探讨不同压榨时间和方式对面神经压榨伤大鼠模型稳定性的影响,以期为针灸治疗面神经损伤的机制研究提供更可靠的动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物健康SD雄鼠40只,7～8周龄,体重200～250 g,由成都达硕实验动物有限公司提供,许可证号:SCXK(川)2015-030。

1.2 试剂和仪器水合氯醛(批号:LQC0R85);0.9%生理盐水(批号:L218011305);多聚甲醛(批号:20160512);苏木素(批号:LM10N13);伊红(批号:GL01-GMPC);二甲苯(批号:20160512);徕卡RM2016转轮式切片机;数码三目摄像显微镜BA400Digital(麦克奥迪实业集团有限公司);金钟蚊式眼科弯钳(批号:002017);金钟直眼科剪(批号:180402)。

1.3 建立压榨伤模型大鼠购回后以每笼4只的标准,并实施适应性喂养1周,维持室温23 ℃左右,12 h明暗交替,并且每日定时通风换气,大鼠自由摄食及饮水。使用随机数字表法将40 只SD大鼠分为1min Ⅰ组、1 min Ⅱ组、3 min组、5 min组和正常组。大鼠禁食12 h后进行造模。麻醉时采用腹腔注射10%水合氯醛(0.04 mL/kg),以大鼠全身瘫软,呼吸均匀,双耳及脚趾红润不泛白,对夹尾刺激无反应为宜。按照无菌操作对手术器械及手术台进行严格消毒,铺上一次性医用铺巾,在深度麻醉的大鼠后进行耳后剃毛,使其右侧卧位并固定于手术台,消毒备皮,在手术显微镜下,沿耳根后缘行一弧形切口,钝性分离暴露右侧茎乳孔,找到从茎乳孔穿出的面神经主干,用蚊式眼科弯钳尖端压迫,力量为3扣,压迫宽度为2.0 mm左右。根据组别不同选择不同的压榨方法,1 min Ⅰ组:压迫30 s,松开30 s,同一部位反面压迫30 s;1 min Ⅱ组、3 min组和5 min组分别持续压迫1 min、3 min和5 min[7];正常组不做特殊处理。在伤口缝合前蘸取适量青霉素粉涂抹于各组大鼠的伤口处,防止感染。术后将大鼠放置于保温垫上,并随时监测生命体征,待其完全苏醒后再放回笼中,术后当日控制食物摄入。

1.4 模型评价标准术后第1天观察各组大鼠触须运动及瞬目反射情况。触须运动:观察一定时间内动物双侧触须活动频率,双侧触须细微颤搐、节律性拂动的程度,同时观察胡须偏向位置[8]。瞬目反射:使用装18 G针头的5 mL注射器在距眼睛约1～3 cm处打入空气来刺激大鼠角膜诱发瞬目反射[8-9],观察动物双侧眼部肌肉活动情况,是否存在瞬目反射及眼睑闭合情况。参考Simone 10分法[8,10]对大鼠面神经功能进行评分,将触须运动评分表与瞬目反射观察表所得分数相加,低于4分者视为造模成功。Simone 10分法评分细则见表1,表2。

行为学评分操作由两名不知晓实验分组并受过专业培训的评估人员同时进行,如出现评分不一致的情况,需进行第二次评估,直至两人评分统一。

表1 触须运动评分表

表2 闭眼、瞬目反射观察表

1.5 观察指标

1.5.1 行为学观察 术后第1天和第14天采用Simone 10分法对各组大鼠瞬目反射和触须运动进行评分,评估大鼠面部功能损伤及恢复情况(操作同上)。

1.5.2 面神经病理损伤检测 术后第14天行为学评分后,10%水合氯醛(0.04 mL/kg)腹腔注射麻醉,待其深度麻醉后解剖暴露患侧面神经,迅速截取面神经干放入4%多聚甲醛中固定,使用HE染色法将面神经组织制作成切片,在光镜下观察面神经组织病理学改变并对其病理损伤进行分级评分[11-12]。I级损伤(1分):面神经形态正常,束膜完整,未见脱髓鞘改变,髓鞘排列均匀,大体形态可稍见肿胀充血;Ⅱ级损伤(2分):面神经形态基本正常,损伤处可见明显肿胀充血,神经束内纤维与束膜贴合,远端髓鞘呈点片状溶解破裂丧失,近端部分轴突点、片状空泡样变,部分可见毛刺样突起;Ⅲ级损伤(3分):面神经结构损伤,形态不完整,神经连续性中断,髓鞘、轴突排列紊乱、大部分溶解,变薄呈大泡样,仅束内小部分损伤程度较轻;Ⅳ级损伤(4分):面神经组织结构基本消失,神经束状结构崩解消失,呈丝网状结构,高度肿胀充血,可见髓鞘、轴突溶解破裂,远端神经脱髓鞘改变。

1.6 统计方法应用SPSS 22.0软件进行统计分析,计量资料以“均数±标准差”表示,数据服从正态分布和方差齐性,采用单因素方差分析,不服从正态分布,采用非参数检验(Kruskal-Wallis秩和检验),以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态观察术前各组大鼠精神状态良好,活动灵敏,皮毛光泽顺滑,饮食及二便如常,面部各表情肌活动正常。术后第1天,正常组大鼠状态如前;各造模组大鼠精神状态欠佳,皮毛干枯不光泽,轻微便溏,患侧面部出现眼睑闭合障碍,睑裂变宽,触须后倒,抖动幅度减弱,甚至失去拂动能力,鼻尖偏向健侧。术后第3天各造模组便溏症状缓解。术后1周,各造模组大鼠伤口基本愈合,面部功能活动逐渐恢复。均无感染及死亡。

2.2 行为学评分结果术后第1天,与正常组比较,1 min Ⅰ组、1 min Ⅱ组、3 min组和5 min组评分均显著降低,低于4分,差异有统计学意义(均P<0.01),而4种造模组评分组间比较差异无统计学意义(均P>0.05),提示造模成功;术后第14天,与正常组比较,1 min Ⅰ组、3 min组和5 min组评分显著降低,差异有统计学意义(均P<0.01),1 min Ⅱ组评分降低,差异有统计学意义(P<0.05),而4种造模组评分组间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 各组行为学评分比较

2.3 面神经损伤病理结果

2.3.1 面神经损伤病理观察 正常组:面神经结构完整,有髓神经纤维分布密集均匀,未见脱髓鞘改变;1 min Ⅰ组(8-8):有髓神经纤维中重度减少,神经明显肿胀变性,胞质空泡变性明显;1 min Ⅱ组(8-6):有髓神经纤维排列较整齐,神经局部肿胀,空泡样变性;3 min(8-7)和5 min组(8-7):有髓神经纤维排列松散,纤维密度轻度减低,神经局部肿胀、空泡变性较明显。见图1。

图1 各组大鼠面神经组织HE染色观察结果(×400)

2.3.2 面神经损伤病理评分比较 术后第14天,与正常组比较,1 min Ⅰ组、3 min组和5 min组评分均显著升高,差异有统计学意义(均P<0.01),而1 min Ⅱ组评分与正常组差异无统计学意义(P>0.05);与1 min Ⅱ组比较,1 min Ⅰ组评分显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),3 min组和5 min组评分均升高,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠面神经损伤病理评分比较

3 讨论

面神经走行于人类曲折而狭窄的骨管中且行程最长,因其特殊结构在体内外致病因素的刺激下易发生神经水肿、受压、缺血或炎性反应等病理变化,从而引起面部表情肌运动功能障碍[13]。为了使动物模型尽可能地模拟人类面瘫的实际病理情况,多种动物被使用于周围性面瘫造模实验。其中,啮齿类动物尤其常用,如大鼠,小鼠,兔以及豚鼠等[14]。而大鼠具有价格便宜、易于饲养、表情肌发达、胡须灵活运动以及面神经分布与人类相似等优点,同时为了更好地针刺操作,本课题组拟将其作为面神经损伤实验的首选[8]。然而,本研究需要持续针刺14 d,而大鼠作为啮齿类动物,其面部神经具有特殊的再生能力,因生存需要,其鼻唇部肌肉运动频率高,而这种高频率的运动有助于面瘫症状的恢复。因此,在本研究中我们进一步观察了造模14 d后大鼠周围性面瘫模型的稳定性。

同时,我们基于现有文献发现,针对周围性面瘫致病因素与病理机制的不同存在多种造模方法,如面神经切断法,面神经压榨法,寒冷刺激法,面神经牵拉法,阻断血管法以及接种病毒法等[15]。其中,针对大鼠面神经干浅在,易暴露的特点,压榨法具有操作简便、可重复性高,病理变化典型和便于进行修复评估等诸多优点,是目前在针刺治疗面神经麻痹的动物实验中最常用的模型[16]。同时,不同病因导致的面神经损伤均可由该模型模拟,如桥小脑角区肿瘤引起的面神经颅内段受压[17]、外伤所致出茎乳孔的面神经主干损伤[18]或腮腺肿瘤切除术后面神经分支的损伤[19]等。然而,文献中面神经压榨伤模型的制备在压榨时间和方式上存在差异,常用的压榨时间从5 s～5 min不等[20],还有压榨10 min[21],甚至40 min[22],同时压榨方式也有单面和正反面压榨之分[15]。因此,为了建立符合针刺研究需要的、稳定的面神经压榨伤模型,本研究以大鼠为研究载体,在穿出茎乳孔的面神经主干进行压榨,塑造了神经受压导致的面瘫,并且选取1 min、3 min与5 min三种压榨时间进行对比研究。

面部肌肉在面神经受损后会出现运动障碍,并且损伤神经段可能发生显著的解剖形态学改变,发生神经水肿,脱髓鞘改变,神经变性以及面神经核细胞超微结构改变等病理变化[23]。基于此,研究者可从大鼠的行为以及面神经的病理状况评估面神经损伤程度与修复状况,行为学评估可选择瞬目反射、触须运动、鼻尖偏向等,并且可以选择更为客观的病理形态学证据如HE染色、电镜照片以及甲苯胺蓝染色等[8]。故本次实验中使用Simone10分法综合评估大鼠触须、闭目瞬目情况,利用HE染色进行观察面神经的整体结构、神经纤维脱髓鞘改变以及细胞变性等病理改变。而本研究结果发现,在一定时间内随着持续压榨时间的增加,损伤加重,但卡压3 min与5 min造成的损伤及恢复情况大致相同,提示随着压榨时间无限延长,损伤可能并不会无限加重,同张海燕等[12]的实验结果。此外,本研究对1 min单面压榨与1 min正反面压榨两种压榨方式进行对比研究,初步探讨了压榨方式对面神经压榨伤大鼠模型稳定性的影响,结果发现压榨30 s,松开30 s,反面压榨30 s的方法对面神经损伤重于持续压榨1 min,甚至重于持续压榨3 min和5 min,可能是由于正反面操作更能保证压榨部位面神经全面受压的原因,更多原因有待进一步探讨。同时,我们观察到四种压榨造模组大鼠面神经功能在14 d内均未完全恢复,与研究[24]结果相符,故本研究可为观察周期在14 d内的创伤性面神经损伤研究提供稳定且可靠的大鼠模型,为团队后续进行针刺治疗面神经损伤大鼠相关机制的研究奠定了基础。

综上,本次实验证明压迫30 s,松开30 s,反面压迫30 s的造模方法是本次实验面神经损伤最为严重且全面的方式,而单面压榨3 min至5 min可能是单面压榨造成面神经损伤最大的时间段。基于以上观点,在具体实验中可以结合上述方法选择不同造模时间,建立多种面神经损伤程度的动物模型。同时,已有研究证实[25]面神经恢复与坐骨神经恢复具有相似的时间进程,因此本研究的结果或许能对坐骨神经压榨伤模型的制备提供参考。