快速冷驯化条件下稻水象甲内参基因的筛选及LoTPS基因表达

祁立中,王 晓,王庆泰,王 尚,张炬红

(吉林大学 植物科学学院,吉林 长春 130062)

稻水象甲(LissorhoptrusoryzophilusKuschel)是一种对水稻危害极强的世界性检疫害虫[1],也是我国农业上重要的植物检疫性害虫之一。稻水象甲首次被发现是在1800年的密西西比河流域,1988年5月在我国河北省唐山市唐海县发现,目前,在我国大部分水稻种植区域均有报道[2]。在稻水象甲生长发育过程中温度发挥着至关重要的作用,影响其越冬虫源基数、成虫出土时间、迁飞规律、种群消长规律及危害[3-5]。稻水象甲耐寒能力较强,在我国黑龙江省局部地区已成功入侵[2],表现了对低温的强大适应能力。有研究表明,稻水象甲滞育期成虫体内海藻糖含量高于生长发育期,稻水象甲可通过提高海藻糖含量提升自身对低温的适应能力[6],稻水象甲滞育期的海藻糖合成酶基因上调表达[7-8]。目前,海藻糖合成酶作为害虫控制的重要靶标已经引起了许多生物学家的广泛关注,基于对海藻糖合成酶的影响,RNAi技术和海藻糖合成酶抑制剂的开发可以为稻水象甲的绿色防控提供新思路。

实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qPCR)作为基因表达水平分析的一种重要方法[9],因其具有准确、快速、特异性强等特点,在分子生物学研究中被广泛应用[10]。但是qPCR的实际应用过程中会受模板质量、聚合酶活性和引物扩增效率等因素影响对结果造成误差[11]。为了消除此类误差,需要一类可以稳定表达的基因作为内参基因对qPCR结果进行校正,进而保证结果的准确性[12]。因管家基因如肌动蛋白基因(ACT)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)等是一类参与细胞生命活动维持的基因,并且通常假定它们在不同的测试条件下表达一致,在对目的基因进行标准化时长被用作内参基因。目前,针对昆虫利用qPCR 技术进行内参基因筛选报道很多,但多数研究结果表明,内参基因可能在不同的环境条件下会出现表达水平的变化[13-14]。因此,在进行基因表达水平分析前,有必要在特定条件下分析和评估候选内参基因的稳定性。

为了进一步研究稻水象甲体内海藻糖代谢通路相关基因的表达和功能,本研究基于前期测得的稻水象甲成虫转录组数据筛选出10条候内参选基因,在评价和分析其qPCR表达稳定性的基础上选择适合不同快速冷驯化条件下的内参基因,进一步分析海藻糖合成酶基因LoTPS在快速冷驯化条件下的表达模式,旨在为LoTPS基因在稻水象甲低温适应性中的作用机制研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试昆虫

稻水象甲成虫:2020年6月采集自吉林省长春市郑家屯水稻田,饲养于实验室盆栽水稻内备用。饲养温度为(25±2)℃,光照周期为16 h光照/8 h黑暗。

1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂RNAiso Plus(TaKaRa,日本)、反转录试剂盒PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(诺唯赞,中国)、2×SGExcel Fast SYBR Mixture(With ROX)(生工,中国);荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,美国);冰箱(海尔,中国);超微量分光光度计(Bio-RedTM,美国);-80 ℃超低温冰箱(Panasonic,日本)。

1.3 快速冷驯化处理

选取个体大小一致,发育状况良好的稻水象甲成虫,分别于0 ℃(诱导温度)低温下冷驯化处理4,6,8,10 h。冷驯化结束后,将存活成虫立即转移至-8 ℃(检测温度)处理2 h[8],调查成虫死亡情况。分别以室温饲养和未经快速冷驯化从室温直接转移到-8 ℃处理2 h的成虫为对照,分析快速冷驯化对稻水象甲成虫低温适应性的影响。每处理18头成虫,重复5次。将各处理存活的成虫经液氮快速冷冻后,放-80 ℃冰箱内保存备用。

1.4 总RNA提取及cDNA合成

参照RNAiso Plus试剂使用说明书提取稻水象甲成虫总RNA,并通过超微量分光光度计检测其纯度和浓度。取500 ng检测合格的RNA后,cDNA的合成按照PrimeScripTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒操作说明进行。

1.5 内参基因的筛选和克隆

通过查阅实验室前期测定的稻水象甲转录组数据库,并参考常用昆虫内参基因[15-18],选择15个具有完整开放阅读框的基因作为候选基因,经NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对与其他昆虫同源基因序列的相似性验证分析之后,确定其中11个序列为候选基因。

PCR扩增时以常温条件下饲养的稻水象甲成虫为试验材料提取总RNA,反转录后得到的cDNA为模板,通过Primer Primer 5.0软件设计的引物(表1),进行PCR克隆。PCR反应体系(25 μL):cDNA模板1 μL,正反引物(10 μmol/L)各1 μL,2×Phanta Max Buffer 12.5 μL,dNTP 0.5 μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL,最后补加9.5 μL的ddH2O。扩增条件:95 ℃ 3 min预变性;95 ℃ 15 s变性,55 ℃ 15 s退火,72 ℃ 30 s延伸,共35个循环;彻底延伸5 min。最后经1%凝胶电泳检测PCR 产物。

表1 PCR和实时荧光定量PCR引物Tab.1 Primers for PCR and qPCR

1.6 荧光定量PCR

以稻水象甲成虫合成的cDNA 为模板,表1设计的引物进行荧光定量PCR试验。总反应体系为10 μL:包括5 μL的2×SGExcel Fast SYBR Mixture,1 μL的cDNA模板,各0.4 μL的上、下游引物(10 μmol/L)和3.2 μL的 ddH2O。按照以下程序进行扩增:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性 10 s,55 ℃ 退火30 s,进行40个循环;溶解曲线:65～95 ℃,每个循环上升0.5 ℃。每个样品均进行3次生物学重复和3个技术重复。反应结束后根据绘制的溶解曲线分析引物的特异性。

1.7 内参基因表达稳定性分析

采用ΔCt、geNorm[19]、BestKeeper[12]和NormFinder[20]4种方法综合分析待选内参基因表达的稳定性。ΔCt法通过候选基因在每个处理中的相对表达丰度来确定最适内参基因,通常Ct值为15～30。geNorm通过计算平均变异度(Mean variability,M)来确定最适内参基因,要求M<1.50,且M值越小说明候选基因越稳定。Norm Finder根据各基因表达稳定值(Stability value,SV),筛选出最适的内参基因,SV越小表明基因表达越稳定。BestKeeper软件首先比较每个基因之间Ct值产生变异系数(CV)和标准偏差(s)来判断内参基因表达的稳定性,然后依据s和CV值的大小进行排序分析,s和CV值越大,表明内参基因表达的稳定性越差;反之,稳定性越好。上述方法中,geNorm和NormFinder输入数据时需要将Ct值进行 2ΔCt的转化,ΔCt和BestKeeper输入原始数据即可。

1.8 数据分析

利用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计学分析,用单因素方差分析(Anova)对数据进行处理,用邓肯新复极差法进行多重比较,分析不同快速冷驯化条件下LoTPS基因的表达差异。

2 结果与分析

2.1 候选内参基因的筛选

根据稻水象甲转录组数据注释结果,筛选出15个包含完整开放阅读框(ORF)的管家基因作为候选基因,使用DNAMAN 5.0将核苷酸序列翻译为蛋白序列,通过NCBI Blast进一步比对后,选择11个一致性较高,E值较小的序列为候选内参基因。根据Blast最佳匹配项命名,分别为核糖体蛋白L18、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、核糖体蛋白S27、11S核糖体蛋白、TATA盒结合蛋白、核糖体蛋白L13、18S核糖体蛋白、3S核糖体蛋白、α-微管蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和精氨酸激酶(表2)。除RPS3和α-tubulin基因外,其余基因均与象甲科昆虫基因序列一致性较高。

表2 候选内参基因的Blast筛选Tab.2 Blast screening of candidate reference genes

2.2 引物特异性评价

以常温条件下饲养的稻水象甲成虫cDNA为模板,对11条候选基因进行qPCR扩增,电泳检测结果表明,除RPS3外,其余10对基因均获得单一且明亮的条带,产物长度与软件预测长度相似(图1),确定了克隆基因的正确性与特异性。进一步验证10条基因在不同处理下的qPCR表达结果表明,10条内参基因引物的溶解曲线均有明显单一峰值,即无非特异性扩增,表明所设计引物具有较好的特异性。

M.2000 DNA 标准分子量;1.RPL13基因;2.G6DPH基因;3.RPS11基因;4.α-tubulin基因;5.RPL18基因;6.RPL27基因;7.GADPH基因;8.TBP基因;9.AK基因;10.RPS18基因。M.2000 DNA Marker;1.RPL13 gene;2.G6DPH gene;3.RPS11 gene;4.α-tubulin gene;5.RPL18 gene;6.RPL27 gene;7.GADPH gene;8.TBP gene;9.AK gene;10.RPS18 gene.

2.3 候选内参基因的表达水平分析

内参基因的表达丰度是筛选内参基因的首要条件,由Ct值变化可知,在不同快速冷驯化条件下,各候选基因均具有较高表达,但表达量不同(图2)。通常Ct值应为15～30,除TBP(22.48～33.61)、RPS11(29.36～37.41)表达略低以外,其他候选基因的Ct值均在此范围以内,其中RPS18Ct值最低,表达量最高,其次为RPS27。

稻水象甲候选内参基因表达水平由不同处理的原始Ct 值表示。箱型上下线分别为上四分位数和下四分位数,中线为中位数,中垂线的上下限分别为最大值和最小值。The expression level was shown in terms of the raw cycle threshold number(Ct value)of the candidate reference genes of L.oryzophilus under different treatment conditions.The box represents the values between the 25 th and 75th percentiles,the line in the box indicates the median value,and the whisker caps denote the minimal to maximal value．

2.4 基于geNorm软件对候选内参基因稳定性分析

经geNorm软件对候选基因表达稳定度M值的比较分析表明,除RPS11外,其他内参基因的M值均小于0.7,表明这9个基因可以作为不同快速冷驯化条件下基因表达分析的内参基因使用,各候选内参基因表达稳定性顺序依次为G6DPH>RPS18>RPL18>RPS27>GADPH>α-tubulin>AK>RPL13>TBP>RPS11(图3)。

图3 利用geNorm软件对各候选内参基因表达稳定性的分析Fig.3 Expression stability anlysis of candidate reference genes by the geNorm software

2.5 基于NormFinder软件对候选内参基因稳定性评价

通过NormFinder软件对候选内参基因稳定性的分析,发现各内参基因稳定性有一定的差异,排序依次为:G6DPH>RPS18>RPS27>RPL18>GADPH>α-tubulin>AK>RPL13>TBP>RPS11,与geNorm 分析结果基本一致,其中G6DPH稳定性最好,其次为RPS18,RPS11最差(图4)。

图4 NormFinder软件分析各候选内参基因表达稳定值Fig.4 Expression stability values of candidate reference genes by the NormFinder software

2.6 基于BestKeeper软件对候选内参基因稳定性分析

根据BestKeeper软件对10个候选内参基因标准差(s)大小比较分析结果,其表达稳定性排列顺序依次是:RPL13>α-tubulin>GADPH>RPS27>G6DPH>RPS18>RPL18>RPS11>AK>TBP;根据变异系数(CV)表达稳定性排序为α-tubulin>RPL13>RPS11>G6DPH>GADPH>RPS27>TBP>RPL18>AK>RPS18(表3)。

表3 BestKeeper软件分析候选基因的表达稳定性Tab.3 The expression stability analysis of candidate genes by BestKeeper software

2.7 综合分析候选内参基因的稳定性

本研究通过内参基因稳定性评价的常用软件geNorm、NormFinder和BestKeeper以及ΔCt法,对10条候选内参基因进行分析,综合分析结果表明,除BestKeeper软件外,ΔCt法及geNorm和NormFinder 2种软件分析结果基本一致。表达相对稳定的内参基因为RPS18、G6DPH、RPS27和RPL18,有3类编码核糖体蛋白的基因,RPS3和RPS11在低温处理过后Ct值波动范围较小,但表达丰度最低,不适合做内参基因(表4)。根据表4进行综合评价后发现,在快速冷驯化条件下,稻水象甲体内表达相对稳定的内参基因是RPS18和G6DPH,但G6DPH基因表达丰度较低,故选择RPS18为本研究所用内参基因。

2.8 LoTPS基因在不同快速冷驯化条件下的表达模式

通过对候选内参基因在快速冷驯化条件下稳定性的综合评价和分析后,以RPS18为内参基因测定了稻水象甲海藻糖合成酶基因LoTPS在快速冷驯化条件下的表达模式。由图5可见,经过快速冷驯化后稻水象甲成虫体内LoTPS基因表达量有所增加,随着冷驯化时间的延长,LoTPS基因表达量显著升高。与CK和Non-RCH相比,快速冷驯化4 h(RCH-4)后,其表达量分别提高了1.84,1.80倍,但与驯化6 h的成虫之间无显著差异,驯化8,10 h后,其表达量显著增加。Non-RCH的成虫与CK间LoTPS基因表达量无显著差异。

CK.常温饲养;Non-RCH.不经历快速冷驯化直接-8 ℃暴露2 h;RCH-4.快速冷驯化处理4 h;RCH-6.快速冷驯化处理6 h;RCH-8.快速冷驯化处理8 h;RCH-10.快速冷驯化处理10 h。柱上不同字母表示差异显著(P<0.05)。CK.Normal feed;Non-RCH.Explosion 2 h under-8 ℃ without RCH;RCH-4.RCH treatment for 4 h; RCH-6.RCH treatment for 6 h;RCH-8.RCH treatment for 8 h;RCH-10.RCH treatment for 10 h.Different letters above bars mean significant differences(P<0.05).

3 结论与讨论

qPCR技术是一种高效、简便的基因表达分析方法,选择合适的内参基因是实现 qPCR 可靠性的基本要求。内参基因作为一类可以在不同物种、不同组织、不同发育时期和不同处理中均能稳定表达的基因,是直接影响实时荧光定量PCR结果的一个主要因素。但随着越来越多的研究发现,没有一种“万能的”内参基因可以在任何条件下均稳定表达。因此,使用计算程序如BestKeeper、NormFinder和 geNorm等来评估内参基因的性能,并确定特定物种或生物样品在测定条件下的最佳内参基因是十分必要的。李晓等[11]在鞘翅目大灰象甲(Sympiezomiasvelatus)成虫体内,筛选出TUB、TUA、RPS20和RPL20可以作为其成虫不同组织中基因表达水平的内参基因;Xie等[21-22]却发现在华北大黑鳃金龟(Holotrichiaoblita)中RPL13a和RPL18能在不同发育时期,不同组织和不同温度处理下可稳定表达,Xie等和Xu等[21-22]发现RPS18和RPL18在华北大黑鳃金龟的不同性别和苜蓿切叶蜜蜂(Megachilerotundata)的不同生育阶段及不同环境条件下均可稳定表达。在马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)的不同发育阶段和不同组织中能稳定表达的是RP4和RP8内参基因[23]。家蝇在不同发育时期、不同组织的RNA干扰和饥饿胁迫下,RPS26和RPL23的组合适用于所有供试样品[18];贾冰等[24]发现温度、杀虫剂和幼虫发育历期等条件的变化能够影响牧草盲蝽内参基因的表达稳定性。以上研究均表明,曾很长时间认为稳定的管家基因表达可随测试条件而发生变化。

稻水象甲在我国是一种危害性极强的外来入侵害虫,对我国水稻生产安全有极大的威胁。本研究根据前期转录组测序结果,筛选出10个候选内参基因,对其在不同快速冷驯化条件下的稳定性进行筛选,选择合适的内参基因后分析海藻糖合成酶基因在快速冷驯化条件下的表达模式,以期为相关基因在稻水象甲入侵和扩散过程中的作用和功能研究奠定基础。分别采用ΔCt法和geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件对筛选的10个内参基因的稳定性进行评估,结果表明:在不同快速冷驯化条件下,不同重复间内参基因表达较稳定,不同处理间表达稳定性不同,说明常用的内参基因在快速冷驯化条件下,表达并不稳定。geNorm和NormFinder分析结果趋势基本相同,但均与BestKeeper分析结果有所差异,在geNorm软件中稳定性排名前四的内参基因为G6DPH、RPS18、RPL18和RPS27,根据NormFinder软件分析排名前四的基因与前者相同,只是次序有所不同,而BestKeeper分析的结果与前两者均不相同,有较大差异,主要原因可能是3种软件的计算原理不同。在其他昆虫的研究中也发现了类似现象,如瓜实蝇(Bactroceracucurbitae)、大灰象甲和松墨天牛(Monochamusalternatus)等。为了消除不同软件分析的差异,可以通过将所有软件的分析结果进行综合排序来评估内参基因的稳定性,得到最终排名结果,本试验筛选出在快速冷驯化条件下表达稳定性较好的内参基因为RPS18。

本研究对快速冷驯化条件下稻水象甲的内参基因进行了筛选,发现在稻水象甲体内可以稳定表达的内参基因是RPS18,以其为内参基因进一步对LoTPS基因在快速冷驯化条件下的表达模式进行了分析,结果表明,稻水象甲成虫经历快速冷驯化后LoTPS基因表达量显著增加,这可能有助于提高其成虫在低温下的适应能力,使其顺利度过早春及初冬气温不稳定的冷热交替季节。