MC3T3-E1细胞成骨模型的建立及局部黏着斑激酶表达的研究*

曹志威,邵 国,赵志军,张春阳

(1.内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古包头 014040;2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经外科;3.深圳市龙岗区第三人民医院转化医学中心;4.包头医学院神经外科疾病研究所;5.内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心)

MC3T3-E1细胞(胚胎期小鼠颅顶处分离出的前骨细胞)是基础实验中最常用的成骨样细胞系之一,在体外可被当作一种理想模型来研究成骨细胞分化,通常应用于骨发育及修复等相关领域。研究者们在体外尝试使用不同配方的培养基来诱导其成骨[1],并通过添加或减少某种细胞因子、药物或生物材料来评估其对MC3T3-E1细胞的成骨作用[2]。

局部黏着斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)是蛋白酪氨酸激酶超家族中的一员,在大部分哺乳动物中均有表达,并且能通过多种途径参与调节细胞的黏附、迁移、增殖分化等[3]。本课题前期实验证实,FAK在大鼠颅骨发育过程中的表达是逐渐升高的,在第10周时达到最高值,然后趋于稳定,并且该趋势与大鼠颅骨发育规律基本一致。这提示FAK可能作为大鼠颅骨快速发育的生物标志物之一。

在此,我们应用成骨分化培养基建立了MC3T3-E1细胞成骨模型,并通过茜素红化学染色和成骨相关基因的表达情况鉴定了该模型。此外,确定了FAK在该细胞诱导成骨过程中的表达规律,这一结果为探索小儿颅骨生长发育过程中关键分子的变化,寻找小儿颅骨生长高峰期的生物标志物提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 本实验选用MC3T3-E1细胞(小鼠颅顶前骨细胞)购自武汉普诺赛生命科技有限公司(中国武汉,CL-0378)。

1.1.2试剂 α-MEM完全培养基(中国武汉普诺赛生命科技有限公司,CM-0378);0.25 %胰蛋白酶-EDTA(美国Biological Industries公司,2147381);PBS (美国Biological Industries公司);MC3T3-E1细胞成骨诱导分化培养基(含10 %FBS的α-MEM完全培养液+100 nmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+0.2 mmol/L抗坏血酸)、茜素红(Alizarin red S)染料购自[中国赛业(广州)生物科技有限公司,MUXMT-90021];DEPC水(美国Sigma公司,D5758);总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司,15596026);异丙醇、无水乙醇(天津市永大化学试剂有限公司);氯仿(北京化学工业试剂公司);cDNA反转录试剂盒(美国Thermo Scientific公司,00760321);引物委托上海生工公司合成;SYBR Green PCR Master Mix(中国北京康为世纪公司,CW0659S)。

1.2方法

1.2.1MC3T3-E1细胞成骨诱导 MC3T3-E1细胞在CO2培养箱中(设置温度37 ℃,CO2浓度为5 %),使用含10 %胎牛血清、1 %青霉素G钠盐和硫酸链霉素的α-MEM完全培养基培养。每隔2～3 d更换一次培养基。当细胞合并程度达85 %左右时,加入0.25 %胰蛋白酶EDTA进行消化并传代。待细胞生长稳定后,将MC3T3-E1细胞按1×106/瓶接种到T25的培养瓶中,每瓶加入4 mL的α-MEM完全培养基,当细胞合并程度达70 %左右时,更换为MC3T3-E1细胞成骨诱导分化培养基,前14 d内每2～3 d进行一次全量换液,14 d后每隔3 d进行1次半量换液,直至21 d。整个培养过程中每隔2 d在显微镜下拍照并做好实验记录。

1.2.2茜素红化学染色 MC3T3-E1细胞以1×105/孔的密度接种于六孔板中,每孔加入适量的α-MEM完全培养基完全铺满孔板底部,然后将六孔板放在CO2培养箱中(设置温度为37 ℃,CO2浓度为5 %)培养,每隔2～3 d全量换1次培养基,当细胞合并程度达70 %左右时,用PBS洗涤2遍,往板中每孔加入1.5 mL的MC3T3-E1细胞成骨分化培养液,前14 d内每2～3 d全量换液1次,在诱导14 d后每3 d半量换液一次,诱导分化21 d和28 d后,PBS轻柔漂洗2次,往板中每孔加入1.5 mL 4 %多聚甲醛室温固定30 min,PBS轻柔漂洗2遍,然后滴入2 mL茜素红染料,室温静置5 min,PBS轻柔漂洗2次。显微镜下查看矿化结节的大小及分布情况。

1.2.3qRT-PCR 检测FAK及成骨相关基因表达 将MC3T3-E1细胞按1×106/瓶接种到T25的培养瓶中,每瓶加入4 mL的α-MEM完全培养基,待细胞合并程度达70 %左右时,其中1个培养瓶直接进行RNA提取,作为0 d对照组,其余组的细胞培养液更换为MC3T3-E1细胞成骨诱导分化培养基,培养至3 d、7 d、14 d、21 d时,分别进行RNA提取。使用总RNA提取试剂Trizol提取细胞总RNA,无酶水溶解后用Nanodrop(Thermo Fisher,美国)测量RNA浓度,使用cDNA反转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA。在罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪上使用SYBR Select Master Mix进行定量聚合酶链式反应。通过对照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的归一化来确定相对基因表达水平作为内对照,并使用△△CT方法进行定量。PCR引物序列在表1列出。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.4统计学分析 通过SPSS 25.0处理数据,应用Graphpad Prism 8绘制统计图表,多样本均数两两比较使用单因素方差分析(one way ANOVA)。P<0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1MC3T3-E1细胞成骨诱导前后形态 MC3T3-E1细胞培养6 h时已完全贴壁,生长状态较好,形状饱满,呈短梭形,胞体和细胞核较小。使用成骨分化诱导培养基培养3 d后细胞呈长梭形或多角形,胞体和细胞核变大,有多个树枝状突起(图1 A-C)。

图1 MC3T3-E1细胞成骨诱导前后形态比较注:A:成骨前(100×);B-C:成骨第3 d(400×)

2.2茜素红染色 对MC3T3-E1细胞使用成骨分化诱导培养基培养数周后,用茜素红染料对其进行染色,结果出现了橘红色沉淀,显示出明显的钙化。并且随着诱导时间的延长,这种钙化程度越明显(图2 A-C)。

图2 茜素红染色结果(橘红色部分为可见的矿化结节)注:A:成骨第21 d(40×);B:成骨第28 d(40×);C:ARS定量测定

2.3FAK和成骨相关基因的表达 在成骨诱导后的第0、3、7、14、21 d收集细胞(未诱导即第0 d),检测Runx2和ALP这两种成骨细胞标志物的mRNA水平表达,并分析FAK基因的表达。

随着诱导时间的延长,Runx2和ALP的表达呈持续升高的趋势,至21 d时达顶峰(图3)。FAK与Runx2和ALP的表达类似,总体呈升高趋势,虽在第7 d时略有下降,但还是高于第0 d(图3)。

图3 MC3T3-E1细胞成骨诱导后FAK及成骨相关基因ALP和Runx2 mRNA的表达注:*与第0 d比较,P<0.05

3 讨论

MC3T3-E1细胞在含抗坏血酸和地塞米松等诱导因子的成骨分化培养基中能够很好地向成骨细胞分化,模拟颅骨的生长过程。最新研究表明,FAK可作为骨细胞内机械转导的感受器,通过感应流体剪切力(Fluid Shear Stress,FFSS)的变化,将机械信号转化为生物化学信号后传入细胞内,并参与骨细胞的增殖、分化、迁移等一系列生命活动[4],而在心肌细胞中FAK同样可作为压力感受器参与上述功能[5]。

因此,本实验选择MC3T3-E1细胞,在体外对其进行成骨诱导培养,通过茜素红化学染色和成骨相关基因的表达情况确定该模型的成功建立,并观察在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中FAK的表达情况,为颅骨生长发育的理论研究提供可能线索。

本研究在对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导时,从以下3个方面鉴定了该模型。第一,从细胞形态上,发现未诱导时细胞呈短梭形,进行成骨诱导后细胞逐渐呈长梭形,并伸出多个树枝状突起,胞体和胞核逐渐变大,符合成骨细胞的形态[6];第二,经茜素红化学染色,显微镜下查看成骨分化第21 d和28 d的细胞,结果显示二者均有明显的矿化结节,并且第28 d的结节密度和面积大于第21 d,矿化结节的出现是细胞成骨分化的标识之一[7];第三,成骨相关基因检测,Runx2是细胞成骨过程中的一种重要转录调节因子[8],它通过激活多种信号通路来调节细胞的增殖和分化[9]。ALP有4种主要同工酶,其中组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)被发现与骨钙化有关,是成骨早期指标之一[10]。我们检测到二者在此模型中均持续增加,这与大多数文献描述一致[11]。

在此基础上,我们检测了FAK的表达,其与成骨相关基因Runx2、ALP的mRNA水平表达趋势几乎一致,这提示FAK或许在MC3T3-E1细胞成骨过程中起着一定作用。在颅骨生长发育过程中,颅内压也不断变化,这提示二者可能存在某种潜在联系,基于本实验,我们猜测FAK很可能在颅骨细胞中作为压力感受器感受颅内压的变化进而调控颅骨的生长发育。在进一步的实验中,可以对MC3T3-E1细胞施加一定的压力或通过转染等技术手段,来观察压力与FAK对成骨分化的影响,为进一步揭示FAK在颅骨生长发育中的具体作用机制提供新的线索。