人参皂苷Rb1对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠神经保护作用的初探*

代玉晶,孙建芳,贾建新,杨占君,霍东升

(1.包头医学院2020级研究生,内蒙古包头 014040;2.包头医学院)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的中枢神经系统退行性疾病之一,多好发于中老年人,其发病率仅次于阿尔茨海默病[1]。PD的主要临床症状表现为静止性震颤、动作迟缓、肌强直和肌力下降等运动学症状及抑郁、嗅觉、睡眠和感觉障碍等非运动学症状[2]。在病理上表现为中脑黑质致密部多巴胺能神经元渐进性丢失和路易小体(α-Synuclein)的形成以及纹状体区多巴胺(Dopamine,DA)递质降低、DA与乙酰胆碱递质失衡等生物化学水平改变[3]。目前,PD的治疗多以针对多巴胺能和胆碱能神经元的药物为主,主要有拟多巴胺化合物、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶-B抑制剂、儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂以及抗胆碱能药物等,它们大多通过增加脑内多巴胺水平或模拟多巴胺效应,改善患者症状,提高患者的日常生活自理能力。而这些药物必须长期服用,且存在较大的不良反应,长期服用可导致严重后果(如停药后症状加剧)。因此,开发有效且不良反应较小的治疗药物对于PD来说具有更重要的临床价值。

人参(PawaxgiwsewgC.A.Mey.)为五加科人参属的一种,是多年生草本植物。药用人参为植物人参的根部,人参的用药历史十分悠久,早在《神农本草经》就有记载:“人参,味甘微寒,主补五脏,安精神,定魂魄,止惊择,除邪气,明目,开心益智。”PD在中医范畴属“肝风”、“内风”、“震颤”、“颤证”等,《黄帝内经》称震颤为“掉”和“振掉”。人参用以治疗PD古代典籍已有记载,如《本草衍義》和《丹溪先生心法》中“筋急拘挛语迟脉弦加薏苡仁,若筋急加人参”,提示人参可能具有缓解PD症状的作用。人参的主要活性成分有人参皂苷、生物碱、多糖、葡糖苷和酚酸等,研究表明,人参皂苷对PD具有较好的治疗作用[4,5],但主要集中在GsRg和GsRe,而有关GsRb1的报道较少。Zhang等[6]研究报道GsRb1可以改善PD模型小鼠的运动障碍,防止DA能神经元死亡。本研究通过腹膜腔注射 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)制备PD模型,探讨GsRb1对PD模型小鼠运动行为的影响和作用,拟寻求其最佳保护剂量,为GsRb1对PD保护作用的可能机制研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1实验动物 选用8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠,体质量范围为20～24 g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,批号:SCXK(京)2019-0010。造模前先适应性饲养一周,饲养环境为室温23～25 ℃,标准湿度55 %～60 %,光照和黑暗各12 h,自由饮水、进食,分笼饲养。

1.2试剂和仪器 GsRb1购自北京索莱宝科技有限公司(批号:129k022),用生理盐水溶解,配成4 mg/mL的溶液备用;MPTP购自美国Sigma公司(批号:M0896),用生理盐水配置成3 mg/ml备用;疲劳转棒仪(型号:XR1514)购自上海欣软信息科技有限公司。

1.3方法

1.3.1动物分组与处理 C57BL/6小鼠随机分为对照组(control)、模型组(MPTP)、GsRb1低剂量组(Rb1-L)、中剂量组(Rb1-M)和高剂量组(Rb1-H),共5组,每组各10只,参考文献设计给药方案[7,8]。对照组小鼠-3～0 d,6～11 d,每次按10 ml/kg的剂量腹膜腔注射生理盐水,1～5 d,每天腹膜腔注射生理盐水2次;MPTP模型组小鼠-3～0 d,6～11 d,每天腹膜腔注射生理盐水1次,1～5 d,每天腹膜腔注射生理盐水和MPTP各1次;MPTP+Rb1各剂量组小鼠-3～11 d,每天将GsRb1分别以10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg腹膜腔注射1次,1～5 d每天腹腔注射MPTP 1次。所有的PD模型小鼠,均连续5 d腹膜腔注射30 mg/kg的MPTP。MPTP和Rb1的注射时间间隔需超过12 h(MPTP在8:00 am给药,Rb1在8:00 pm给药),在第12 d进行小鼠行为学检测实验。动物实验按照包头医学院动物实验指导原则进行,动物实验经包头医学院动物实验伦理委员会批准。

1.3.2行为学检测 (1)转棒实验:小鼠的运动协调性通过转棒实验进行评估。实验前将小鼠置于疲劳仪的旋转棒上,给予30 s适应环境。启动疲劳仪,使转杆转速达到25 r/min,红外装置在300 s内记录小鼠从转棒上落下时在转棒上移动的时间,作为小鼠转棒实验的下落潜伏期。即小鼠第一次从转棒上掉下来的时间。每只小鼠检测3次下落潜伏期,每次间隔至少30 min,取平均值为小鼠下落潜伏期。(2)爬杆实验:将直径2 cm的小球,固定于直径1 cm、高50 cm的铁杆顶端,全部用纱布包裹以防止小鼠打滑。测试时将小鼠头向下放置于杆的顶端,记录小鼠爬到杆底部的时间,以双前肢接触到平台为准。连续检测5次取平均值,每次间隔1 min。(3)悬挂实验:采用自制悬挂实验箱,将被测小鼠两前爪置于一根直径为1.5 mm,30 cm长,25 cm高的金属杆上,然后放开小鼠,记录其抓握情况。 评分标准:两后爪均可抓住金属杆,记4分;一只后爪可抓住金属杆,记3分,两只后爪均不能抓住金属杆,记2分;若出现后爪反复抓取金属杆,间断可抓住现象,记1分。

1.3.3统计学方法 实验数据采用SPSS 17.0软件对数据进行分析,计量资料以均数±标准差表示。多样本均数比较采用单因素方差分析 ( One way ANOVA) ,两两比较采用LSD法检验,样本服从正态分布,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1转棒实验 与对照组相比,MPTP组小鼠掉落潜伏期显著降低(P<0.01);与MPTP组比较,GsRb1低剂量组掉落潜伏期升高,但不具有统计学意义(P>0.05),GsRb1中剂量组和高剂量组掉落潜伏期均升高,均具有统计学意义(P<0.05);各剂量组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 GsRb1对PD模型小鼠转棒掉落潜伏期的影响注:与空白对照组比较,** P<0.01;与MPTP组比较,#P<0.05

2.2爬杆实验 与对照组比较,MPTP组小鼠爬杆时间显著升高(P<0.01);与MPTP组相比,GsRb1中剂量组爬杆时间明显降低(P<0.01),低剂量组和高剂量组爬杆时间均显著降低(P<0.05)。给药组之间比较,GsRb1中剂量组较低剂量组爬杆时间明显降低(P<0.05)。见图2。

图2 GsRb1对PD模型小鼠爬杆时间的影响注:与空白对照组比较,**P<0.01;与MPTP组比较,##P<0.01,#P<0.05;与GsRb1低剂量组比较,&P<0.05

2.3悬挂实验 与对照组比较,MPTP组小鼠悬挂实验评分显著降低(P<0.01);与MPTP组比较,中、高剂量组小鼠评分明显升高(P<0.05);各剂量组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 GsRb1对PD模型小鼠悬挂评分的影响注:与空白对照组比较,**P<0.01;与MPTP组比较,# P<0.05

3 讨论

PD是一种好发于中老年人的慢性进行性神经退行性疾病,由于中脑黑质致密部多巴胺能神经元退变,导致纹状体多巴胺丢失,一方面直接解除对苍白球内侧部神经元的抑制,另一方面间接增强丘脑底核神经元活性,增加苍白球内侧部介导的丘脑抑制,最终导致出现运动迟缓、肢体僵直。MPTP目前已被广泛应用于PD模型的制备,其可穿过血脑屏障,在星形胶质细胞中被单胺氧化酶代谢后转化为MPP+,后者通过多巴胺转运体蛋白摄入聚集在多巴胺能神经元的线粒体中,抑制线粒体复合物I的活性,引起神经元变性坏死,这与PD的病理改变较为类似,可以较好地模拟PD的病理生理学变化和运动障碍症状。

GsRb1具有多种药理活性,尤其在中枢神经系统、心血管系统、免疫系统以及抗肿瘤等方面研究广泛。在中枢神经系统方面,GsRb1具有中枢抑制和安定作用,并具有改善学习记忆能力、抗脑缺血损伤等神经保护作用。课题组在前期研究中使用H2O2处理PC12细胞,发现PC12细胞存活率下降,而GsRb1可以有效抑制上述作用,发挥一定的细胞保护作用[9]。众所周知,α-synuclein异常聚集是PD重要发病机制之一。Ardah等[10]证实GsRb1可以抑制α-synuclein的纤维化和毒性作用,不仅可以分解纤维化的α-synuclein及其聚合,而且可以稳定可溶性的没有毒性的α-synuclein低聚物,从而使其被蛋白激酶K消化。有报道发现GsRb1可通过上调谷氨酸转运体GLT-1,改善MPTP诱导PD模型小鼠的运动障碍,防止DA能神经元死亡[6]。GsRb1对PD模型小鼠神经保护作用的量效关系未见报道,据此本实验通过三种动物行为学评价方法,包括协调性、运动能力、肌力等,来观察GsRb1对PD模型小鼠运动障碍的改善效果,寻求GsRb1的有效保护剂量。本实验结果显示,给予MPTP后,小鼠的行为学表现为掉落潜伏期显著降低,爬杆时间明显升高,悬挂实验评分显著降低,说明MPTP发挥其毒性作用,导致小鼠肌力、运动能力下降,运动协调性差。给予GsRb1预处理后,小鼠掉落潜伏期明显升高,尤其是中、高剂量组与MPTP组差异有统计学意义,结果提示小鼠的运动协调性随药物剂量增加而持续改善。在反映小鼠肌力情况的两个实验中发现,中、高剂量组小鼠悬挂实验评分显著升高,而低剂量组却无显著性差异;在爬杆实验中,GsRb1三个剂量组与MPTP组均存在显著性差异,且以中剂量组效果最佳;结果也提示,小鼠肌力的改善与GsRb1的剂量相关,可能中剂量组的效果较好。

综上所述,GsRb1能够改善MPTP诱导PD模型小鼠的运动能力、肌力及协调性,给予20 mg/kg剂量GsRb1预处理即可能对抗MPTP的毒性作用,起到较好的神经保护效果。