种猪常温精液畸形率检测及不确定度评定

薛 冰

（ 辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，辽宁 辽阳 111000 ）

为适应生猪产品消费市场需求和养猪业快速发展需要，辽宁省先后从丹麦、瑞典、美国、加拿大等国引进长白、大白、杜洛克等猪种。与本地猪相比，这些引进品种具有瘦肉率高、饲料报酬高和生长速度快等特点，市场竞争优势明显，得到快速普及和推广。但近年来由于生猪遗传改良工作滞后，导致种猪质量提高进展缓慢，形成“引种-退化-再引种”恶性循环，良种对养猪业发展的推进作用越来越不明显。因此，以加强引进种猪遗传改良为突破口，完善种猪测定、质量检验和遗传评估体系建设，不断提高种猪质量，建立自主种源体系，方可打破“引种-退化-再引种”恶性循环，对提高全省种猪质量、规范种猪市场秩序、保障生猪种源安全和推动养猪业高产、优质、高效发展具有十分重要的作用。

精液品质影响种猪人工授精的成功率，种猪常温精液畸形率测定是精液品质检测一项重要指标。测量不确定度是与测量结果相关的参数，是判定测定结果质量的依据[1-2]。而不确定度可用于表征种猪精液品质检测结果是否具有可靠性，因而对种猪常温精液品质的符合性判定起到至关重要的作用[3]。本试验根据GB 23238—2021 的要求[4]对种猪常温精液品质进行检测，分析种猪常温精液检测畸形率全过程，对影响畸形率检测结果准确性的因素进行探讨，评定影响其测定结果的不确定度分量，为检测结果的可靠性和种猪精液符合性评定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 精液

试验所用的10份种猪常温精液来自锦州某供精站。

1.1.2 主要试剂及仪器

ML-810JZ 全自动动物精子分析仪（南宁松景天伦生物科技有限公司）、10 μL 移液器（EPPENDORF）以及小吸管、载玻片、血细胞计数器、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醛、甘油、吉姆萨染料等，所用试剂均为分析纯，所用耗材均须无菌、无毒[5]。

检测室内要求干净、整洁，配备控温和控湿设备，保证工作时室温在20～25 ℃，相对湿度在35%～55%，并做好温湿度记录[6]。

1.1.3 试剂配制

配制磷酸盐缓冲液：0.55 g 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）和2.25 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶于蒸馏水并定容至100 mL容量瓶。

配制中性福尔马林固定液：0.55 g 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）和2.25 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶于约50.0 mL 0.89%氯化钠，溶解后加入8.0 mL 40%甲醛（使用前经碳酸镁中和过滤），再加入0.89%氯化钠溶液定容至100.0 mL。

吉姆萨染液：吉姆萨原液2.0 mL 与磷酸盐缓冲液3.0 mL、蒸馏水5.0 mL混合，现配现用。

1.2 试验方法

种猪常温精液按照GB 23238—2021 要求进行检测，试验由检验人员独立检测10份种猪常温清液，用数字标记好精子畸形率指标。

1.2.1 制片、染色

抹片：吸取一滴精液滴于载玻片一端，取另一载玻片（要求边缘光滑）与放置样品的载玻片呈35°并轻轻滑动，均匀地将样品涂于载玻片上，自然风干摆放约5 min，每个样品须制作两个相同抹片。

福尔马林固定：将1.0～2.0 mL中性福尔马林固定液滴于已风干的抹片上，固定时间15 min，用蒸馏水冲去固定液，自然风干。

吉姆萨染色：取固定好的抹片，反扣于有平槽的有机玻璃上，将吉姆萨染色液用滴管滴于槽中，使染色液完全覆盖抹片和平槽，染液充分接触抹片，染色1.5 h，之后用洗瓶冲去染液，放置晾干待检[7]。

1.2.2 精子畸形率

取制备好的抹片置于显微镜下观察，调整视野为400～600 倍，每个抹片观察左、右两个区各200 个以上的精子，观察顺序为从左到右、从上到下，边观察边计数，计算两个抹片畸形率的平均值。两个抹片畸形率差值不大于6[8]可认为符合要求，不符应重新按上述流程制作[4]。精子畸形率按公式（1）计算：

式中：A为畸形率；A1为畸形精子数；S为精子总数。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

建立不确定度数学模型，得到畸形率测量结果不确定度主要来源评定的重复性，故属于A类不确定度。计算标准不确定度、相对扩展不确定度，得出其扩展不确定度。

2.2 不确定度数学模型的建立

根据GB 23238—2021 的规定，按标准测定方法以及公式建立的测量不确定度数学模型见公式（1），为种猪常温精液检测畸形率的测量不确定度。由公式（1）可知，A1、S为种猪精液品质精子畸形率不确定度的分量来源。

2.3 仪器不确定度计算U(t)

可查询全自动动物精子分析仪投影显微镜的分辨率（△）为0.1 μm，假定生物投影显微镜的分辨率最大允差为均匀分布，其产生的不确定度为：U(t)=△/k=0.005 8。

2.4 检测不确定度计算

图1 种猪常温精液精子畸形率的平均值和标准偏差Fig.1 Mean and standard deviation of sperm malformation rate in normal temperature semen of breeding pigs

表1 种猪常温精液精子畸形率Tab.1 Sperm abnormality rate of boar normal temperature semen

试验结果也可采用扩展不确定度表示，取包含因子K=2，则扩展不确定度为U=K×U（M）＝1.68%（置信概率约95%）。

3 讨论

研究表明，精子畸形率是除精子活力之外，对受精率影响最大的指标[9]。本文建立测量不确定度模型，通过检测种猪常温精液精子畸形率，针对主要影响种猪精子畸形率检测结果可靠性的因素进行分析，建立种猪精液品质检测结果可靠性评估的方法。检测方法依据《种猪常温精液》（GB 23238—2021），不确定度计算依据《用蒙特卡洛法评定测量不确定度》（JJF 1059.2—2012）。

本试验中精子畸形率的检测设备为生物投影显微镜。付雪林等[3]认为，生物投影显微镜分辨率产生的不确定度分量对精子畸形率检测产生的准确度影响最小，与本文仪器不确定度的计算结果（0.005 8）相符。本试验检测结果表明，生物投影显微镜分辨率产生的不确定度分量对精子畸形率检测产生的准确度影响较小。李何君等[10]结果表明，精子畸形率检测标准不确定度为0.9%，扩展不确定度为1.8%，与本研究结论相近。

精子畸形率是精子经染色液染色后在显微镜下判别畸形精子的比率。常见的精子染色方法有吉姆萨染色法[11]、考马斯亮蓝染色法[12]、伊红染色法[13]等，本试验参考国家标准《种猪常温精液》（GB 23238—2021），采用吉姆萨染色法对精子进行染色，精子染色后检测确定配制吉姆萨染色液的浓度不会对结果产生影响。精子畸形率检测时需要检验人员用肉眼在显微镜下进行计数，不同的操作人员对畸形精子的评判标准也会存在差别[3]。此外，制样和固定、镜检过程中的操作对精子畸形率测定结果也会产生影响，因此，操作人员的技术水平对精子畸形率的不确定度分量的影响较大。

种猪常温精液是开展人工授精技术的基础，是提高猪人工授精率的关键因素。抓好种猪常温精液生产的各个环节，建立健全精液的质量监管体系，如精液的生产、检测、保存和运输等过程，能够保证优秀种公猪的精液品质，充分发挥优秀种公猪的种用价值，提高母猪的受胎率和产仔数，促进养猪业健康发展[14]。猪常温精液供精中心可实现优秀种猪精液规模化储存和大范围的资源共享，养殖户使用猪常温精液可降低饲养成本，阻断引种造成的传染性疾病传播，减轻防疫工作压力，加快猪群品种改良速度，提升良种覆盖率，大幅提高养殖收益[15-16]。对猪常温精液精子畸形率等各项指标进行检测分析可为优秀种质资源的筛选和使用提供依据，把好质量关，对增加养殖效益、推动养猪业持续健康发展具有重大的作用。此外，为验证检测结果的准确度也可定期将样本送至其他具有检测资质的实验室进行检测结果的比对、分析[7]，查找差距以提高自身检测结果的准确性。

4 结论

本研究中精子畸形率的检测设备为生物投影显微镜，经检测后产生的不确定度分量对精子畸形率检测的准确度影响较小。精子着色的深浅由配制吉姆萨染色液浓度的准确性影响，配制染色液的浓度准确性不会对精子畸形率产生影响。实验室检测精子畸形率是在显微镜下进行计数，检验人员在制样和固定、镜检过程中的操作对精子畸形率测定结果具有决定性作用，对精子畸形率的不确定度分量的影响较大。

综上所述，在今后的实验室质量监控活动中，应加强人员技术评比以及对相关理论知识的学习，提高技术人员试验操作过程的熟练程度，多进行岗位练兵，以达到提高检测精子畸形率准确度的目的，也可增加检测次数提高检测结果的可靠性。实验室在选择生物投影显微镜时要多进行比较，以减少试验设备对试验结果的影响。