蝾螈AGR2 基因的生物信息学分析

冯亚龙，蔡惠敏，张鑫钰，王露晴，王文蕾，山有玲，蔡璐璐

（ 咸阳师范学院化学与化工学院，陕西 咸阳 712000 ）

前梯度蛋白（anterior gradient，AGR）属于蛋白质二硫异构酶家族，包括AGR1、AGR2、AGR3[1-4]。AGR2 首次在非洲爪蟾中被发现，与胚胎外胚层的形成密切相关[5-7]。越来越多的研究表明，AGR2 与癌症进展关系密切，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、食管癌和前列腺癌等[8-13]。蝾螈是两栖类脊椎动物，具有较高的观赏价值，但在饲养过程中当其皮肤出现伤口时，常因为患水霉病而死亡，可见促进其伤口愈合对预防水霉病非常重要。最新研究表明，AGR2能够加速小鼠皮肤伤口愈合，提示AGR2可能对蝾螈皮肤伤口愈合至关重要[14]。此外，蝾螈在肢体受损后能够再生出完整肢体，这种超强的再生能力令科研工作者着迷，揭示蝾螈肢体再生的分子机制对指导伤残肢体再生至关重要[15-18]。已有研究表明，蝾螈肢体成功再生在伤口表皮与肢体神经的交互作用下完成，两者缺一不可[19-20]。AGR2 在蝾螈再生肢体神经鞘的雪旺氏细胞中高表达，并且AGR2 能够恢复蝾螈去神经肢体的再生能力。由此可见，AGR2在蝾螈肢体再生中起到关键作用[21-23]。然而，目前对蝾螈AGR2基因的基本生物学信息知之甚少，阻碍了对其进一步研究。因此，本研究拟通过多种生物信息学分析软件对5 种蝾螈AGR2 基因的基本生物学信息进行分析，为其进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据来源

从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank数据库中获取斑点钝口螈（HQ676606.1）、美西钝口螈（KC253228.1）、东方蝾螈（KF146225.1）、绿红东美螈（EF667357.1）、黑斑肥螈（KC295222.1）、非洲爪 蟾（CAJ82848.1）、牛（DAA30743.1）、鳄龟（KAG6939899.1）、野 鸽（PKK32056.1） 、人（EAL24283.1） 、小鼠（AAH13334.1） 、大 鼠（EDM03310.1） 、斑 马 鱼（AAI52145.1）、原鸡（XP_418698.1）、大西洋鲑鱼（XP_014033406.1）的AGR2核苷酸序列及编码氨基酸序列。

1.2 数据统计与分析

利 用ProtParam 工 具（http://www. expasy. org/tools/protparam.html）预测AGR2 基因编码蛋白质的理化性质，包括分子量、等电点、分子式、原子总数、不稳定指数、脂溶指数和平均亲水性指数等。

利 用SignalP 4.1（https://services. healthtech. dtu. dk/service.php?SignalP-4.1）预测AGR2 信号肽；采用NCBI Conserved Domain Search 预测其结构域；AGR2 的二级结构信息分析采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）。

利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）网站对蝾螈AGR2 蛋白进行同源建模，采用Pymol软件分析其三级结构。

利用DNAMAN 7.0 软件进行多个物种AGR2 氨基酸序列比对分析；最后利用MEGA 5.05软件构建AGR2蛋白系统进化树。

2 结果与分析

2.1 蝾螈AGR2蛋白的基本理化性质分析（见表1）

由表1 可知，5 种蝾螈AGR2 基因的开放阅读框均为501 bp，编码166个氨基酸。5种蝾螈AGR2蛋白质的分子量大致相等，均为18 kD左右；等电点值接近，分别为9.01、8.87、9.16、9.20、9.16。蝾螈AGR2 蛋白质的不稳定指数均小于40，表明其为稳定蛋白质；蝾螈AGR2 蛋白的脂溶指数为93.37～102.77，平均亲水性指数为-0.368～-0.286，表明其属于亲水性蛋白质。

2.2 蝾螈AGR2的信号肽分析（见图1）

由图1 可知，5 种蝾螈的AGR2 均为分泌蛋白，预测的信号肽剪切位点位于20～21氨基酸残基处。

2.3 蝾螈AGR2的二级结构分析（见图2）

由图2可知，斑点钝口螈的AGR2包含45.18%的α-螺旋、7.23%的β-折叠、16.27%的延伸链、31.33%的无规则卷曲；美西钝口螈的AGR2 包含43.37%的α-螺旋、6.02%的β-折叠、17.47%的延伸链、33.13%的无规则卷曲；东方蝾螈的AGR2 包含48.19%的α-螺旋、6.02%的β-折叠、13.86%的延伸链、31.93%的无规则卷曲；绿红东美螈的AGR2包含48.19%的α-螺旋、5.42%的β-折叠、15.06%的延伸链、31.33%的无规则卷曲；黑斑肥螈的AGR2 包含51.81%的α-螺旋、7.23%的β-折叠、12.05%的延伸链、28.92%的无规则卷曲。

2.4 蝾螈AGR2的三级结构分析

通过Swiss-Model 同源建模网站搜索发现蝾螈的AGR2序列与人AGR2（PDB code: 2lns）最接近。由建模结果可知，蝾螈AGR2 蛋白包含4 个α-螺旋和3 个β-折叠，这种结构与硫氧还原蛋白折叠相似（见图3）。保守结构域分析表明，蝾螈AGR2在第38～166氨基酸残基处存在硫氧还原蛋白类超家族结构域。此外，催化结构域位于第2个α-螺旋的N末端。

图3 蝾螈AGR2蛋白三级结构分析Fig.3 Tertiary structures analysis of newt AGR2 proteins

2.5 AGR2氨基酸序列比对分析（见表2、图4）

图4 AGR2蛋白多序列比对Fig.4 Multiple sequence alignment of AGR2 proteins

表2 AGR2氨基酸序列同源性分析Tab.2 Amino acid sequence homology analysis of AGR2 单位：%

由表2、图4 可知，5 种蝾螈AGR2 氨基酸序列彼此高度相似，斑点钝口螈与美西钝口螈、东方蝾螈、绿红东美螈、黑斑肥螈的同源性分别为94.85%、86.99%、82.53%、87.67%；美西钝口螈与东方蝾螈、绿红东美螈、黑斑肥螈的同源性分别为86.99%、83.56%、87.67%；东方蝾螈与绿红东美螈、黑斑肥螈的同源性分别为89.16%、96.99%；绿红东美螈与黑斑肥螈的同源性为90.36%。5 种蝾螈与非洲爪蟾具有较高的同源性，斑点钝口螈、美西钝口螈、东方蝾螈、绿红东美螈、黑斑肥螈与非洲爪蟾的同源性分别为73.05%、72.46%、75.62%、73.42%、75.00%。

此外，所有物种AGR2硫氧还原蛋白类超家族结构域氨基酸序列十分保守。

2.6 AGR2系统进化树分析（见图5）

图5 AGR2系统进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of AGR2

由图5可知，该进化树共分为2个大类，其中5种蝾螈聚成一个亚类并与非洲爪蟾聚成一个大类，哺乳动物、爬行动物、鸟类、鱼类聚成一个大类。由此可知，蝾螈AGR2在进化上与同为两栖类的非洲爪蟾AGR2亲缘关系较近，与哺乳动物、爬行动物、鸟、鱼AGR2的亲缘关系较远。

3 讨论

AGR2在蝾螈伤口愈合及肢体再生过程中扮演重要角色，因此，解析其生物学信息对预防水霉病及指导人类肢体再生至关重要。本研究对5种蝾螈AGR2基因的生物信息进行了分析，结果显示，这5种蝾螈AGR2基因的核苷酸序列及编码氨基酸序列彼此高度相似，AGR2 蛋白质的基本理化性质、二级结构、三级结构也十分相似。已有研究显示，蝾螈AGR2能够与芽基细胞表面的Prod1受体结合，表明蝾螈AGR2是一种分泌蛋白，与本研究预测的结果一致[24]。与其他物种相同，蝾螈AGR2 蛋白包含一个硫氧还原蛋白类超家族结构域，其中含有一个催化结构域和一个内质网滞留序列，该结构域十分保守，因此可推测蝾螈AGR2 可能与保持内质网稳态密切相关，并且可以以其他物种AGR2 的功能为指导研究蝾螈AGR2 的功能[2,25-26]。同源性及系统进化树分析结果表明，蝾螈AGR2与非洲爪蟾AGR2亲缘关系最近，与其在进化上的关系一致。本研究将为蝾螈AGR2蛋白功能的进一步研究提供依据。

4 结论

本研究结果表明，5 种蝾螈AGR2 基因编码蛋白质均是由166个氨基酸组成的稳定的亲水性蛋白质，分子量均为18 kD左右，理论等电点为8.87～9.20，存在一个信号肽，其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，三级结构包含一个保守的硫氧还原蛋白类超家族结构域。蝾螈AGR2 与非洲爪蟾AGR2亲缘关系最近。