疾病模型近交系小鼠的繁殖保种方法及措施

张伶燕

（ 中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医院比较医学中心国家人类疾病动物模型资源库 北京市人类重大疾病实验动物模型，北京 100021 ）

小鼠是试验中应用最广泛的动物，易繁殖和饲养，可应用于各类生理、病理、药理以及一些行为学试验[1-4]，其中带有疾病模型的小鼠在疾病相关研究中尤为重要。随着医学研究不断深入、发展，学界对小鼠的繁殖质量要求愈发重视，一些遗传背景较复杂且应用价值较高的品系的繁殖保种技术也越来越重要，保证小鼠质量控制合格以及基因稳定在小鼠应用中起到至关重要的作用。在饲养繁殖过程中，近交系小鼠由于其遗传均一性以及对各种反应的一致性、可再观性、敏感性等均较好的特点，而广泛应用于医学、生物学等领域的各项研究中[5-6]。但近交系因长期近交导致的近交衰退问题尚无很好的解决办法，尤其一些疾病模型的品系由于其自发疾病或其他因素影响，极有可能出现断种不繁殖的问题。因此，能够持续性传代成为繁殖保种过程中亟须解决的重要问题。文章主要针对疾病模型的近交系小鼠品系繁殖保种方法和采取措施进行概述，以期为疾病模型近交系小鼠品系的稳定遗传和可持续繁殖以及动物医学临床研究提供参考。

1 饲养条件

试验动物的繁殖性能与动物种系、环境条件、营养水平等诸多因素有关[7]，试验动物房作为繁育、饲养、开展试验的地点，此处的控制不仅关系到试验动物的福利及健康，更是保障试验数据可靠性和可重复性的关键，对生命科学研究的结果和水平具有深远影响[8-11]。环境控制是试验动物质量标准化的关键因素之一[12]，也是试验动物饲养控制中最基础的环节，是保证试验动物质量的前提条件。

1.1 饲养环境

试验小鼠饲养于隔离器内，独立送排风系统过滤空气后[6]进入隔离器内（空气为初、中、高效三级过滤）。温度20～26 ℃，若温度超过30 ℃会造成雄鼠睾丸萎缩，精子生成能力下降，雌鼠性周期紊乱，泌乳能力下降或拒乳[13]；湿度40%～70%；光照：定时设定小鼠光照时间，每天光照12 h、黑暗12 h。

笼具和垫料：垫料选择刨花木屑经132 ℃、35 min 真空蒸汽高压灭菌。每周更换饲养笼具和垫料，洗刷后均经高温高压灭菌[14]。

丰容玩具：选择可进行高压灭菌的隧道玩具，每2个月重新清洗并进行高压灭菌后使用。

1.2 饲料与饮水

本试验选择中国医学科学院医学实验动物研究所常用饲料A 和免疫缺陷饲料B（高蛋白、高脂肪），依据GB 14924.3—2010[15]方法测定其营养水平，结果见表1。两种饲料分别来自北京两家试验小鼠饲料生产厂，许可证号分别为SCXK（京）2019-0003 和SCXK（京）2019-0010。试验鼠饮用水为酸化水pH 值2.5～3.0，121 ℃、35 min 真空蒸汽高压灭菌，配置方法为1 mL 36%～38%盐酸配15 L水。

表1 试验小鼠饲料营养水平Tab.1 Feed nutrient levels of experimental mice 单位：g/kg

2 饲养方法

2.1 饲养管理

每周一至周三换窝，换窝完成后擦拭隔离器内表面附着粉尘以及手套附着的脏垫料等，将隔离器内物品码放整齐。每天观察小鼠繁殖情况，在繁殖卡片上记录小鼠配种、新生、离乳、死亡、淘汰等数据，卡片记录信息包括品系名称、饲养编号、交配动物编号、出生日期、配种日期、代数、胎数以及父母编号等。新生仔鼠记录胎数、出生日期、产仔数、离乳雌雄数、仔鼠编号以及离乳后饲养笼号。此外，还应观察每盒小鼠状态，包括背毛是否顺滑、有无肿瘤、创伤、烂尾、精神状态、活动度等，出现异常状态的小鼠及时淘汰处理。

2.2 近交系小鼠繁殖

小鼠8 周龄时达到性成熟[16]进行配种，严格遵循同胞交配，繁殖鼠采用雌雄长期同居方法（公母比例为1∶1）[17]，繁育困难品系同窝很难形成一对繁殖对可选择近亲。选择健壮、毛色顺滑，无创伤、无遗传缺陷的小鼠，无折尾、断尾等情况留两条繁殖线进行同时传代，留种选取2～4 胎。同时考虑在对其繁殖力无影响或影响较小的情况下，尽可能选择胎次多的仔鼠育种[18]。每条繁殖线5 对繁殖对以上，留雌雄比例好的后备种，如可形成2∶2、3∶3、4∶4的繁殖对。若出现一条繁殖线无法传代的情况，可从另一条繁殖线进行再次分化成两条繁殖线传代。

2.3 近交系小鼠保种

采用修饰平行线法，分为上下两条平行繁殖线。引种品系为1对种鼠，动物繁殖过程中原始引种第一交配对繁殖后，选留2 或4 对种鼠，上下两条线各1 或2 对种鼠分别选种传代。若引种品系为2对及以上种鼠繁殖过程中，原始引种随机分成2条线分别繁殖。根据生殖能力系数=(总离乳数×7)/生产总天数，统计每条线综合平均生殖能力系数，生产总数从同居配种当日开始计算，根据Festing 设计的6代传代法，繁殖代数以6代计，即每代上溯6代，从上溯6 代的分支中选择一个分支向下传递，选择计算平均生殖能力系数并根据其值判断[19]，见图1。

图1 近交系小鼠繁殖谱系Fig.1 Breeding pedigree of inbred mice

支线1 平均生殖能力系数=（0.90+0.60+1.10+…+0.76）/11=0.66；支线2 平均生殖能力系数=0.30+0.47+0.89+…+0.80=0.42。

通过计算可知，支线1 的平均生殖能力系数高于支线2，故选择支线1进行传代。若突然出现过高的繁殖能力且比较持续，应怀疑品系是否出现污染情况，及时检测遗传位点是否一致。

2.4 小鼠淘汰（针对繁育好且稳定的品系）

2.4.1 老种淘汰

8 月龄以上小鼠一般生6 胎左右可进行淘汰，替换为年轻繁殖力旺盛的小鼠，以保证鼠群的健康以及保持较高生产率。每条线至少有2代小鼠（即父代、子代），有足够空间可留3代再进行更新换代淘老种。

2.4.2 不繁育种子对淘汰

配种后1～2月未发生妊娠或无仔鼠出生，可进行同胞间调种，若调种后1～2月仍未出现妊娠或生仔，表明小鼠不孕不育，需进行淘汰。

2.4.3 根据动物福利选择性淘汰

当动物出现体重下降、消瘦；无法控制的疼痛；肿瘤过度增长或腹水；持续性倦怠伴随背毛粗糙杂乱，无光泽、弓背；异常中枢神经反应（抽搐、颤抖、歪头、瘫痪）；影响进食和饮水等症状时，根据小鼠疼痛评估标准打分，判断是否淘汰，评分累计3分及以上直接淘汰。小鼠疼痛评估标准见表2[20]。

表2 小鼠疼痛评估标准Tab.2 Pain evaluation criteria of mice

3 针对繁育中出现问题的调整措施

由于疾病模型的近交系小鼠在繁育过程中会出现多种情况导致繁育困难，因此，根据每个品系繁殖问题进行针对性的调整和总结，主要分为以下几种情况。

3.1 雌鼠多发疾病导致繁殖障碍或死亡

保留6～10对繁殖对，后备种4～6对左右即可。但对于雌鼠多发疾病的品系小鼠需要保证繁殖对12对以上，后备种至少10对，保种空间足够的情况下留3～5只雌鼠用于繁殖障碍或死亡后进行替换。

3.2 母鼠食仔、拒绝哺乳品系

针对母鼠食仔、拒绝哺乳品系可补充葵花籽、繁殖果冻。孕鼠受惊也会导致食仔和拒绝哺乳的现象[21]（见图2），生产前后2～3 d 避免人为干扰。若发现有食仔或啃食仔鼠现象，应及时取出死亡仔鼠，以免血腥味刺激母鼠进一步吃仔。放入丰容玩具以增加母鼠安全感，在饲养过程中可发现，生产后母鼠多将幼仔放在玩具中，可增加其安全感，提升小鼠离乳率，减少食仔现象。

图2 因母鼠拒绝哺乳导致新生小鼠死亡Fig.2 Newborn mice died when their mothers refused to breastfeed

3.3 攻击性强小鼠

由于小鼠品系野性较强、好斗，配种后甚至出现小鼠打斗撕咬致死的情况。打斗情况不能缓解时，挑出最强者采取单笼饲养。但单笼饲养不符合3R 原则，可放置坐窝纸或丰容玩具[22]。此外，针对打斗严重的品系采取离乳后雌雄即开始共同饲养至配种。据观察，个别品系由于攻击性过强，至配种年龄再进行合笼时极易出现追逐打斗情况，采用离乳后雌雄仔鼠同窝的方法可有效减少配种后打斗现象，提升雌鼠受孕率。每天观察小鼠情况，一旦发现鼠笼中有撕咬打斗现象，除了单独隔离最强者外，轻微受伤个体每天用碘伏消毒，一般5～7 d可痊愈；若撕咬伤口严重无法痊愈，应予以剔除。此外，应避免频繁更换试验人员，以降低不确定因素对小鼠的刺激[23]。

3.4 妊娠母鼠

妊娠母鼠腹部明显膨大或见阴道口湿润张开，表明即将生产（见图3），此时进行适当遮光处理，减少打扰。若有必要可提前将母鼠单独饲养并放置丰容玩具，并适量补充鸡蛋等营养物质。

图3 妊娠母鼠及丰容玩具Fig.3 Pregnant female rats and toys

3.5 新生仔鼠

仔鼠出生第1 d 勤观察仔鼠状态，观察胃部是否出现奶斑，见图4。有奶斑即为带仔，并减少打扰；仔鼠无奶斑且身上附着垫料、黏污，四处散落分布，没有活力，表明母鼠不带仔，此时应及时采取代乳。

图4 新生仔鼠状态观察Fig.4 Observation of neonatal rat status

3.6 配种后不繁殖的小鼠

在设繁育对的同时检查雄鼠的生殖能力。选择1只其他品系的雌鼠作为测试鼠（不同毛色，如C57、ICR等品系）放入繁育对的笼具内，若3周后2只雌鼠均未受孕，则认为该雄鼠不育，需更换雄鼠。若本品系雄鼠数量不足，可将雌鼠与其父本交配。若繁育对的雄鼠可育，配种后3周未见雌鼠妊娠，对雌鼠进行超数排卵。首先将雌鼠取出单独饲养1 周，观察是否出现妊娠，若未发生妊娠则腹腔注射5 U 孕马血清促性腺激素，46～48 h 后注射5 U 人绒毛膜促性腺激素，之后与雄鼠合笼。若超数排卵的雌鼠合笼3周后仍未妊娠，则认为该雌鼠不育，需更换雌鼠。

3.7 对营养具有特殊需求的小鼠

3.7.1 肥胖小鼠

有研究表明，高脂肪日粮对血糖的影响呈剂量相关，并可能增加体内对胰岛素的需求[24]。胰岛素不受控制的产生可能促进脂肪合成，因此控制小鼠脂肪及糖分摄入是控制小鼠体重的关键。糖尿病导致的肥胖小鼠体长、体重明显大于一般小鼠，且多繁殖1～2胎便不再繁殖。针对肥胖小鼠，应将其调整到6周龄配种；日常饲喂维持饲料保证其基本生长维持所需即可，维持饲料增加了纤维含量并降低了能量，减少肥胖小鼠能量摄入以控制体重；还可饲喂二甲双胍缓释片300～400 mg/L溶于饮水，控制其因2型糖尿病导致的过度肥胖，还可明显提升经产母鼠的胎次，从而提升整体小鼠品系的繁殖性能。

3.7.2 高蛋白、脂肪需求小鼠

在饲养过程中发现，一些小鼠饲喂免疫缺陷饲料（高蛋白、高脂肪）后产仔数明显增加，且毛发更顺滑。针对这些小鼠可饲喂前文中的饲料B（高蛋白、高脂肪），增加小鼠产仔数量从而提升其繁殖性能。

4 讨论

与其他近交系小鼠相比，疾病模型近交系小鼠繁殖更为困难，难点主要在于需要克服其因长期近交导致的近交衰退和自身疾病原因导致的繁殖力差甚至不繁殖等问题。试验小鼠均为人工饲养，可通过人为方法控制其繁殖[25]。因此，掌握品系繁殖性能，再根据品系繁殖需要制定合理的繁育措施，方可更具有针对性地提升小鼠的繁殖能力。

通过本文中提出的措施调整，可观察到一些繁殖困难的疾病模型小鼠出现明显好转，可以继续传代。试验动物饲料中蛋白质、维生素等营养物质的含量偏低，易导致试验动物个体偏小、体重偏轻，影响试验动物的生理生化指标，进而对试验动物造成不利影响[26]。有研究表明，在饲养过程中，饲料是保证试验小鼠正常生长繁殖的前提，特别是蛋白质和脂肪的含量对于小鼠的生长繁殖具有极其重要的影响[27]，合理选择试验动物饲料关系到试验动物饲养的质量以及研究的科学性[28]。

有些小鼠品系通过调整饲喂饲料B（高蛋白、高脂肪）可提升小鼠产仔数量，提升小鼠繁育性能，表明一些品系对蛋白和脂肪需求更高。通过对妊娠母鼠的特殊关照以及适当增加一些丰容玩具以供其躲藏，发现母鼠的受孕率、仔鼠离乳率和孕鼠带仔能力均有所提升。肥胖小鼠通过饲喂维持饲料和二甲双胍缓释片等措施，可有效控制体重，并通过提升其产仔量和经产胎次提升小鼠繁殖性能，使小鼠稳定传代。但也不可过度限制营养，尤其是妊娠期、哺乳期母鼠，否则容易因营养不足而出现食仔现象。

5 结论

综上所述，疾病模型近交系小鼠在繁殖保种过程中会遇到很多问题，也需要饲养人员更加细心的照料和观察，结合科学规范的管理与饲养实践中不断完善的繁殖措施方可更好地维持和挽救小鼠品系，使其稳定繁殖。

但随着时间延续，常规活体保种方法的劣势逐渐显现，而建立胚胎冷冻保存技术体系可防止遗传变异和断种、断线，并有效解决近交系小鼠生殖力低下等问题。今后可进行疾病模型近交系小鼠活体保种并结合冷冻胚胎保种的相关研究与实践，以期为疾病模型近交系小鼠品系的稳定遗传和可持续繁殖以及进一步开展动物医学临床研究奠定基础。