山豆根多糖对猪圆环病毒Ⅱ型感染3D4/2细胞增殖活性及炎症信号通路基因调控作用的研究

韦秋旭，赵 怡，杨 剑，陈虹伶，李禧梦，冯国越，胡焜翔，胡庭俊

（ 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005 ）

猪圆环病毒Ⅱ型（porcine circovirus type 2，PCV2）是猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的主要病原体，对全球养猪业造成重大经济损失[1]。PCV2 亦与其他病毒产生共感染，如与猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的混合感染在国内外均造成了巨大的经济损失[2]。且由于病毒基因组不断进化，疫苗在猪生产中难以起到很好的保护作用[3]，因此寻找控制疾病发展的新方法迫在眉睫。

有研究表明，天然化合物具有良好的抗病毒作用[4-5]，中草药中的抗病毒天然化合物的筛选备受关注。山豆根（Sophorae tonkinesisRadix.）是豆科植物越南槐（Sophora tonkinensisGapnep.）的干燥根与根茎，又称广豆根、苦豆根，具有清热解毒、消肿止痛的功效[6]。山豆根多糖（SSP）是从山豆根中提取出的有效多糖成分，具有抗氧化、抗病毒、增强机体免疫等[7-8]活性。课题组前期研究发现，SSP能够降低PCV2感染诱发的RAW264.7细胞的炎症反应[7]。本试验旨在研究SSP对猪肺泡巨噬细胞系3D4/2细胞体外增殖活性的影响及SSP对PCV2感染诱发的炎症相关信号通路基因的调控，旨在为SSP的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PCV2（SH 株）由南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室惠赠，由广西大学动物科学技术学院基础兽医药理实验室经PK-15 细胞增殖保存，通过Reed-Muench法测定病毒滴度为104TCID50/0.1 mL。

试验所用SSP由广西大学实验室提取并保存，内毒素含量＜0.005 μg/g。

3D4/2 细胞为猪肺泡巨噬细胞系传代细胞，由广西大学动物科学技术学院基础兽医药理实验室冻存传代。

1.2 主要试剂与仪器

CCK-8 试剂盒（上海碧云天生物技术）；RNAiso plus（北京宝日医生物技术有限公司）；5× All-in-One Master Mix 及BlastaqTMGreen 2× qPCR Master Mix（爱必梦生物科技有限公司）。

Multimode Plate Reader 多功能酶标仪（瑞士PerkinElmer）；超微量紫外分光光度计（美国GE 公司）；梯度PCR 仪、CFX96TMReal-Time System（美国BIO-RAD 公司）；3K-15 台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）。

1.3 CCK-8 法测定SSP 对PCV2 感染3D4/2 细胞活性的影响

将3D4/2 细胞以1×105cell/mL，以每孔100 μL 铺于96孔板中，共设7组，每组12个重复，于37 ℃、5%CO2条件下培养过夜。经DMEM 完全培养液或PCV2 处理2 h 后，分别加入含药物或不含药物培养液继续培养0、12、24、48 h，终止培养后按照CCK8 试剂盒说明书测定细胞增殖活性。具体试验分组及处理见表1。

表1 SSP对PCV2感染3D4/2细胞活性的影响试验分组与处理Tab.1 Grouping and treatment of the effect of SSP on the activity of 3D4/2 cells infected with PCV2

1.4 qRT-PCR 检测SSP 对PCV2 感染3D4/2 细胞通路相关基因的影响

将3D4/2 细胞以2×105cell/mL，以每孔1 mL 铺于12 孔板中，共设5 组，每组3 个重复，试验分组及处理见表2。

表2 SSP对PCV2感染3D4/2细胞通路相关基因的影响试验分组与处理Tab.2 Grouping and treatment of genes related to the pathway of 3D4/2 cells infected with PCV2 by SSP

作用24 h 后，弃去培养液，PBS 清洗3 次后加入RNAiso Plus 裂解5 min，按照说明书提取总RNA，反转录得到cDNA后按照表3引物进行荧光定量PCR扩增。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequence

反应体系（20 μL）：酶10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8 μL。

扩增条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。熔解曲线按照仪器自身设置进行。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 23.0 软件进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 SSP 对PCV2 感染3D4/2 细胞增殖活性的影响（见图1）

图1 SSP对PCV2感染的3D4/2细胞增殖活性的影响Fig.1 Effect of SSP on proliferation activity in PCV2 infected-3D4/2 cells

为评估SSP 对PCV2 感染的猪肺泡巨噬细胞系3D4/2细胞体外增殖活性调节作用，使用CCK-8 法测定了不同浓度SSP对PCV2感染的3D4/2细胞活性的影响。

由图1（a）可知，各组细胞未经病毒感染和药物作用时，细胞活性水平均在0.95 以上，且各组间差异均不显著（P＞0.05）。

由图1（b）可知，PCV2感染3D4/2细胞12 h后，与细胞对照组相比，PCV2模型组细胞活性极显著降低（P＜0.01）；与PCV2 模型组相比，SSP200 组及SSP400 组细胞活性均显著升高（P＜0.05）。

由图1（c）可知，PCV2感染3D4/2细胞24 h后，与细胞对照组相比，PCV2模型组细胞活性极显著降低（P＜0.01）；与PCV2 模型组相比，SSP100 组及SSP200 组细胞活性显著 升 高（P＜0.05），SSP400 组 细 胞 活 性 极 显 著 升 高（P＜0.01）。

由图1（d）可知，PCV2感染3D4/2细胞48 h后，与细胞对照组相比，PCV2模型组细胞活性极显著降低（P＜0.01）；与PCV2 模型组相比，SSP100 组及SSP200 组细胞活性显著 升 高（P＜0.05），SSP400 组 细 胞 活 性 极 显 著 升 高（P＜0.01）。

综上所述，SSP 浓度小于50 mg/L 时在各时间点对3D4/2 细胞活性无显著影响，与PCV2 模型组相比差异均不显著（P＞0.05）；经100～400 mg/L SSP 处理后，细胞活性在12 h 开始升高，且随着时间增加细胞活性逐渐升高，但均低于正常活性，表明100～400 mg/L SSP 能够显著提高PCV2感染的3D4/2细胞体外增殖活性。

2.2 SSP对PCV2感染3D4/2细胞炎症相关信号通路的影响（见图2、图3）

图2 β-actin、p38和p65基因熔解曲线Fig.2 Melt curves of β-actin, p38 and p65 gene

图3 SSP对PCV2感染的3D4/2细胞炎症信号通路基因表达的影响Fig.3 Effect of SSP on inflammatory pathway gene expressions in PCV2-infected 3D4/2 cells

病毒感染能够诱发细胞内信号通路激活，本试验使用qRT-PCR 检测通路基因表达的变化以得到通路激活情况，结果见图2。由图2可知，荧光定量PCR熔解曲线峰单一无杂峰，引物设计合理，无非特异性产物。

由图3 可知，与细胞对照组相比，PCV2 感染24 h 后3D4/2 细胞MAPK p38 mRNA 表达水平显著上升（P＜0.05）；与PCV2模型组相比，不同浓度SSP作用后，p38表达水平极显著下降（P＜0.01）。与细胞对照组相比，PCV2感染24 h后的3D4/2细胞内NF-κB p65 mRNA表达水平极显著上升（P＜0.01）；与PCV2 模型组相比，各浓度SSP 作用后能够极显著降低3D4/2 细胞内NF-κB p65 mRNA表达水平（P＜0.01）。

3 讨论

细胞增殖是细胞生长的重要生理功能之一，是了解基因、蛋白质和通路作用机制的重要手段[9]。中草药多糖具有提高细胞活性、提升抗氧化能力、抗病毒能力等多种生物活性[10]。Deng 等[11]研究发现，黄芪多糖能够通过促进miR-136-5p 和miR-149-5p 等miRNA 的表达，进而改善高糖和棕榈酸诱导的小鼠胰腺β 细胞凋亡，促进细胞增殖。灵芝多糖-金纳米复合材料能够促进脾细胞中CD4+和CD8+T 细胞的增殖，进而抑制癌症的进程[12]。委陵菜多糖能够增加RAW264.7 细胞NO 的分泌，并增进脾淋巴细胞增殖，激活NF-κB 信号通路[13]。本课题组前期研究发现，SSP在25～400 mg/L浓度范围内对细胞无毒性作用[14]。本研究探讨了SSP 对PCV2感染3D4/2细胞后细胞活性的调节作用，结果显示，100～400 mg/L SSP能够显著调节PCV2感染诱发的细胞活性降低现象，并且呈剂量依赖性。

有研究表明，病毒感染与炎症密切相关。细胞因子通过细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 途径诱导核因子-kB（NF-κB）活性，NF-κB通过释放各种可诱导的炎性细胞因子在炎症反应中起到关键作用[15-16]。NF-κB 信号通路和MAPK 信号通路是重要的炎症信号通路。研究发现，LPS 通过激活NF-κB 与MAPKs 途径导致促炎介质和细胞因子的过量产生[17]。而病毒刺激能够诱发细胞炎症反应，激活NF-κB信号通路途径，药物可通过抑制NFκB活化从而抑制病毒等引发的炎症反应。山柰酚能够通过p38 MAPK 信号通路降低炎性因子的表达发挥抗炎和神经保护作用[18]。江勇等[19]研究发现，白术多糖能够抑制白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）等细胞因子的合成，通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路的活化，进而保护大鼠肠黏膜的免疫功能。

本研究结果显示，PCV2 感染后3D4/2 细胞中p65 和p38 基因的转录水平显著增多，而SSP 作用24 h 能够显著降低其表达，表明SSP 可抑制PCV2 感染诱导的3D4/2 细胞炎症信号通路激活，其抗炎作用与抑制NF-κB 和MAPK通路的激活相关，这可能是山豆根多糖抗炎活性与抗病毒的重要机制，可为SSP的临床应用提供参考。

4 结论

本研究结果表明，100～400 mg/L SSP 作用12～48 h 能够显著提升PCV2 感染诱发的3D4/2 细胞活性，并在作用24 h时显著降低PCV2感染诱发的3D4/2细胞中p65和p38基因的表达，但SSP 是否是通过NF-κB 和MAPK 信号通路调节PCV2诱发的炎症反应仍需进一步试验加以研究。