胡蜂酒薄层色谱和高效液相色谱法指纹图谱研究*

陆礼和，田先娇，田素梅，马艳粉，郭云胶，杨新周，3**

（1.云南省药物研究所，云南 昆明 650111；2.德宏师范高等专科学校 民族医药研究所，云南 芒市 678400；3.德宏师范高等专科学校 理工学院，云南 芒市 678400）

胡蜂酒来源于景颇民族医药，由德宏州瑞丽人梅干家族发明［1］，自1977年以来一直收录在《中华人民共和国药典》中。胡蜂酒不仅可以祛除风湿、治疗急性风湿病、风湿性关节炎，而且对治疗肩周炎、坐骨神经痛、四肢麻木、跌打损伤都有一定的疗效；用法上不仅可以口服，还可以外用［2］。胡蜂酒承载着民族文化和历史的文化。目前对胡蜂酒的研究主要集中在制作工艺上，对胡蜂酒中薄层色谱和液相指纹图谱鲜见报道。

《中华人民共和国药典》中主要记载了胡蜂酒的制法、性状，检查项目主要包括pH、乙醇量、总固体物、其他酒剂有关的各项规定、功能主治、用法用量等［2］。目前仅有彭增荣对胡蜂酒进行了初步的鉴别［3］，郭云胶等研究了胡蜂酒的配制方法［4］，而对于胡蜂酒指纹图谱方面的研究较少。

指纹图谱作为较为完善的药材评价体系，主要分为色谱、光谱和分子指纹图谱等［5-8］。薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography，TLC）是鉴别中药材的常用方法之一，具有简便快捷的特点［9-10］，广泛用于中药材的鉴别、质量控制［11-17］。液相色谱作为目前应用最为广泛的分析技术，具有灵敏度高、适用范围广等优点［5-8］，已广泛用于动植物成分分析与鉴别应用中［18-25］。本研究以胡蜂酒为研究对象，通过高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）建立指纹图谱并进行分析，旨在为胡蜂酒的开发和利用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

实验用纯水为UPR-II优普超纯水机所制超纯水。乙腈、甲酸（色谱纯），异硫氰酸苯酯（PITC），三乙胺等其他试剂均为分析纯。蚂蚁酒（昆明野象谷生物工程开发有限公司，36%）、蝎子酒（山东蒙山酿酒酿酒有限公司，35%）、蛇酒（永州市异蛇科技有限公司，32%）。

胡蜂收集于云南不同地区，经德宏师专郭云胶教授鉴定为胡蜂科金环胡蜂（Vespa mandarinia Smith）。样品信息见表1。

表1 样品信息

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Ultimate 3000，赛默飞世尔公司）。

1.3 方法

1.3.1 胡蜂酒的制作

按照2020版药典，称取100 g鲜胡蜂，加入1000mL白酒，浸泡20 d以上，得胡蜂酒。

1.3.2 薄层色谱鉴定

取胡蜂酒溶液14批，按照薄层色谱法（中国药典通则0502）试验，吸取14批胡蜂酒溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上。以正丁醇-甲酸（体积比50∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃烘至呈现斑点清晰。

1.3.3 HPLC指纹图谱研究

1）色谱条件。色谱柱：AgilentC18柱（Ø4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.0mL／min；柱温：30℃；进样量：10μL；检 测 波 长：254 nm；流 动 相：（A）0.1mol／L乙酸钠（用乙酸调节pH值至6.5）-（B）乙腈，梯度见表2。

表2 流动相梯度洗脱程序

2）供试品溶液的制备。精密移取胡蜂酒2mL，置圆底烧瓶中，60℃ 减压浓缩干燥，残渣加0.1mol／L盐酸溶液10mL溶解，摇匀，备用；精密量取上述供试品溶液各5mL，分别置25mL量瓶中，各加0.1mol／L异硫氰酸苯酯 （PITC）的乙腈溶液2.5mL，1mol／L三乙胺的乙腈溶液2.5mL，摇匀，室温放置1 h后，加50%乙腈至刻度，摇匀。取10mL，加正己烷10mL，振摇，放置10min，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。

3）测定法。分别精密吸取衍生化后的供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2 结果与讨论

2.1 胡蜂酒薄层色谱图

不同产区胡蜂酒薄层色谱图见图1。其中0号为白酒，1～14号样品为胡蜂酒，从图1中看出，胡蜂酒薄层色谱分离度好，斑点清晰。薄层色谱主要为氨基酸薄层色谱，可用于鉴别胡蜂酒。

图1 胡蜂酒薄层色谱图

2.2 方法学验证

色谱图见图2。

图2 样品色谱图

2.2.1 精密度试验

取同一份胡蜂酒样品 （S1），按 “1.3.3中2）项”制备供试液品，按“1.3.3”项下色谱条件连续进样6次，检测指纹图谱，以16号色谱峰为参照，其它各个峰与其比较获得相对保留时间与相对峰面积。各色谱峰相对保留时间RSD≤0.38%，相对保留峰面积RSD≤0.41%，表明仪器精密度良好。

2.2.2 稳定性试验

取胡蜂酒样品（S1），按“1.3.3中2）项”制备供试液品，按“1.3.3”项下色谱条件分别于0、2、4、8、24、48 h进样，以12号色谱峰为参照，其它各个峰与其比较获得相对保留时间与相对峰面积。各色谱峰相对保留时间RSD≤0.45%，相对保留峰面积RSD≤0.81%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.2.3 重复性试验

取胡蜂酒样品（S1），按“1.3.3中2）项”平行制备供试液品6份，按“1.3.3”项下色谱条件测试，检测指纹图谱，以12号色谱峰为参照，其它各个峰与其比较获得相对保留时间与相对峰面积。各色谱峰相对保留时间RSD≤0.45%，相对保留峰面积RSD≤0.81%，表明供试品溶液的制备方法重复性良好。

2.3 指纹图谱建立及相似度评价

取14批胡蜂酒样品溶液，按“1.3.3”色谱条件进样测定，记录色谱图，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2017版）”，设定参照图谱，采用多点校正及谱峰自动匹配，生成14批样品的HPLC指纹图谱及对照指纹图谱，见图3。共确定19个共有峰（见图2）。

图3 14批次胡蜂酒的HPLC指纹图谱

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2017版）进行相似度评价，结果见表3。14批胡蜂酒样品的相似度在0.946以上，说明不同产地的胡蜂酒样品间的化学成分差异较小。

表3 14批次胡蜂酒的HPLC指纹图谱相似度评价结果

2.4 胡蜂酒与其他类型酒的图谱

用同样的方法制备HFJ（胡蜂酒）、SJ（蛇酒）、XZJ（蝎子酒）、MYJ（蚂蚁酒）样品溶液，按照“1.3.3”项下色谱条件进行测试，色谱图见图4。从图4中看出，4种动物酒HPLC图谱既有相似的色谱峰，也存在不同的色谱峰。在16～24min之间，蛇酒未出现色谱峰，蝎子酒出现了一个微弱的色谱峰，蚂蚁酒出现色谱峰与胡蜂酒相似，但强度较低，通过液相色谱可以将胡蜂酒和蛇酒、蝎子酒、蚂蚁酒进行区分辨别。导致4种动物酒出现差异可能是化学成分种类和含量之间存在差异。

图4 胡蜂酒与其他动物酒的HPLC图谱

2.5 聚类分析

以14个不同产区，共有色谱峰峰面积进行聚类分析，可将胡蜂酒分为4类。第一类包括S2、S3、S5、S10、S6、S1、S4、S9、S11、S13，第二类包括S7，第三类包括S12、S14，第四类包括S8（见图5）。

图5 胡蜂酒峰面积聚类分析

2.6 主成分分析

结合胡蜂酒液相色谱图共有峰峰面积相关系数矩阵，计算该矩阵的特征值和方差贡献率，结果见表4。确定了4个主成分，其中，第1、2、3、4主成分对总方差的贡献率分别达到 42.947%、21.263%、13.235%、8.742%。所有研究指标提供信息的85.917%能被前4个主成分反映出来，达到了对不同产地胡蜂酒中共有峰指标评价的降维目的。

表4 相关系数特征值和方差贡献率

将14个不同产区胡蜂酒中19个共有峰峰面积指标进行因子分析，从而对不同产区胡蜂酒共有峰峰面积指标进行降维处理。进一步求出矩阵的特征值、特征向量、贡献率和累计贡献率（表4）。初始因子载荷矩阵、载荷图如表5及图6。从表5和图6中看出，第1主成分与共有峰G1、G2、G3、G5、G10、G11、G12、G13、G15呈正相关，且相关性较强。第2主成分与共有峰4、6、7、9、14、16、17、18呈正相关，第3主成分与共有峰19呈正相关，第4主成分与共有峰G1、G2呈正相关。根据19个共有峰在不同因子上的载荷，可确定共有峰G1、G2、G5、G6、G9、G10、G11、G12、G13、G15、G18与胡蜂酒色谱峰主成分1、2、3、4关联较强。

图6 因子载荷图

表5 初始因子载荷矩阵

3 结论

本研究以不同产地胡蜂酒为研究对象，以正丁醇-甲酸作为展开系统，茚三酮试液为显色剂，建立了胡蜂酒的氨基酸薄层色谱；通过实验得出，胡蜂酒薄层色谱分离度好，斑点清晰，可用于鉴别胡蜂酒。在液相色谱条件 （Agilent C18（Ø4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，乙腈-0.1mol／L醋酸钠溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL／min，检测波长为254 nm，柱温30℃）下，建立了HPLC指纹图谱，并采用中药色谱指纹图谱评价系统进行相似度分析。对共有色谱峰进行聚类分析，可将胡蜂酒分为4类。以胡蜂酒液相色谱图共有峰峰面积相关系数矩阵，计算该矩阵的特征值和方差贡献率，确定了4个主成分，根据19个共有峰在不同因子上的载荷，可确定共有峰G1、G2、G5、G6、G9、G10、G11、G12、G13、G15、G18与胡蜂酒色谱峰主成分1、2、3、4关联较强。通过液相色谱专属性分析，可将胡蜂酒和蛇酒、蝎子酒、蚂蚁酒进行区分辨别。通过建立的胡蜂酒的TLC鉴别方法和HPLC指纹图谱，两种方法简单、可靠，可用于胡蜂酒的鉴别和质量控制。