侵袭性垂体腺瘤中TNF-α IL-6及VEGF之间表达水平变化的相关性研究

刘思洋, 吴建龙, 梅 赞, 苏 彬, 王学文 齐迎松, 李斌斌, 王婷婷, 张金利, 高继刚

(1.河北省承德市中心医院, 河北 承德 067000 2..承德护理职业学院, 河北 承德 067000)

垂体腺瘤约占全颅内肿瘤的15%,只比脑膜瘤与胶质瘤发病率低一些,是颅内肿瘤比较常见的类型之一[1]。垂体腺瘤有可能呈现有异常与无异常激素分泌,据此可划分为非功能性垂体腺瘤与功能性垂体腺瘤,前者可表现为性功能低下、闭经、月经不调、肢端肥大等一系列内分泌方面的症状,后者无明显内分泌增加的症状。垂体腺瘤大都不会对患者的生命造成威胁,属于良性生物学行为表现,但也有25%～55%呈侵袭性生长状态,对于这部分垂体腺瘤,我们称之为侵袭性垂体腺瘤,(invasive pituitaryadenom IPA),IPA通过部分快速生长并侵入周边组织而破坏下丘脑、邻近硬膜、海绵窦等正常结构[2]。目前,针对于侵袭性垂体腺瘤而言,采取手术切除方法会起到良好疗效,主要方法为经鼻蝶窦显微镜、内镜手术。由于该疾病具有侵袭性生长的特点,所以采取手术切除肿瘤很容易留下病灶,这导致高复发率,患者预后不理想[3]。此外,考虑到侵袭性垂体腺瘤独特的生长特点,手术过程中组织可能残留,彻底切除不易,复发率高,加上放疗效果也不太理想。近年来,许多学者将IPA治疗的研究重点放在药物开发上,副作用少、具有高药效、特异性较强的靶向药物就是其中之一,未来可能实现[4]。查阅相关文献,TNF-α、对IL-6和VEGF在侵袭性垂体瘤中的研究也很多,为了能够为IPA的靶向治疗提供一定的理论基础,重点研究了这三种因子在IPA中的表达。

1 资料与方法

1.1标本来源及处理:标本来源于2016年10月至2020年6月的垂体腺瘤标本,均由承德市中心医院神经外科医师在手术切除时所取得,所有患者内分泌检查基本正常,临床症状均未表现出各激素升高引起的表现,部分患者有头晕、头痛症状,经过系统的病理学检查,最终判定这些标本不属于无功能性垂体腺瘤,Wilson-Hardy分为3～4级,术前颅MRI及术中发现肿瘤位于鞍底周围、海绵窦等部位为侵袭性垂体腺瘤。在该标准中,分为无功能IPA 38例、非IPA 18例。标本取材后立即置于-80℃液氮罐内冷冻保存,其余标本用10%中性福尔马林固定。

1.2实验设备和试剂:一抗:TNF-α抗体、IL-6抗体、VEGF抗体(均为小鼠抗人多克隆抗体),抗体由美国Santa Crua生物技术公司生产,二抗:酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物,美国Roche公司生产,显色系为DAB显色系。TRIzol试剂盒由赛默飞生物技术公司生产,采购大连宝生物公司荧光实时定量PCR试剂盒。

1.3免疫组织化学方法:IPA和非IPA组织取材(厚2mm),标本取材后经乙醇梯度脱水、二甲苯等处理后,进行石蜡包埋,然后切片(厚3～4μm),干燥温度60℃以下,持续1h,脱蜡76℃ 16min,修复100℃ 64min,一抗(1∶100的小鼠抗TNF-α、IL-6和VEGF抗体)在37℃孵育24min,苏体素在37℃孵育8min,蓝色在37℃恢复4min。阴性对照与阳性对照分别由PBS与阳性切片代替,细胞浆以棕色黄色为阳性。采用免疫组化半定量方法综合判定阳性和阴性:借助显微镜观察切片,观察范围集中于肿瘤细胞密集区,采取随机挑选方法选择5个视野,结合阳性强度与阳性细胞术做强度评价表达:①0分:阳性细胞数不超过10%;1分:阳性细胞数10%～25%;2分:阳性细胞数25%～50%为2分;3分:阳性细胞数超过50%。②针对染色强度进行评分的标准为:零分代表无着色、一分代表浅棕黄色着色、两分代表棕黄色着色、三分代表深棕黄色角色。判定结果需要将①与②进行综合评定,阴性(-):0分、低表达(+):1～2分、中度表达(2+):3～4分、5～6分为高表达(3+)。

1.4实时定量PCR检测方法:根据TRIzol试剂盒说明书提取组织中总RNA,倒转复制成cDNA,进行cDNA扩增。反应体系合计20μL:TaqDNA聚合酶10μL、上下游引物各0.75μL,cDNA模板1.5μL,ddH2O 7μL。反应条件:预改性95℃30s、95℃5s、60℃30s、72℃30s延长,共40个循环。试剂盒可以选择荧光定量PCR,检查对象为内参基因与目的基因,TNF-α的正向引物序列为5-AAGCTCTGAGCCATTTGTAGGA-3′,反向引物序列为5′-GGGCAGACTTGCCCTTGAA-3′;VGEF正向引物序列为5’-AtGACTTTCTTGGATACA-3’,反向引物序列为5’-TACTCAGGATTTTCTTGT-3’;IL-6正向引物序列是5′-GGCCCTAAACAAGTCTA-3′,反向引物序列是5′-ATATATATCCATCCAGACGAAGCA-3′;β-actin的正向引物序列5’-TAGAGAGTCACTACTCGGCAAT-3’、反向引物序列5’-AAAGAAAGGATAACGCA-3’。测定各组基因相对表达量的方法为2-ΔΔCT法。

2 结 果

2.1免疫组织化学结果:TNF-α试验组阳性表达率为66%(25/38),对照组为22%(4/18),两组差异具有统计学意义(χ2=7.352,P=0.007);IL-6在试验组的阳性表达率为71%(27/38),对照组为28%(5/18),两组差异具有统计学意义(χ2=7.090,P=0.008);试验组VEGF阳性表达率为61%(23/40),对照组为17%(3/18),两组差异具有统计学意义(χ2=7.789,P=0.005)。见图1、表1。

图1 免疫组织化学检测TNF-α、IL-6及VEGF在IPA及NIPA中的表达(SPX200)①③⑤为三者在IPA中的表达呈阳性,②④⑥在NIPA中的表达呈阴性,其中①②为TNF-α,③④为IL-6,⑤⑥为VEGF

表1 IPA及NIPA中TNF-α IL-6 VEGF的表达情况n(%)

2.2实时定量PCR检查结果: IPA中TNF-α mRNA含量明显高于NIPA,差异有统计学意义(t=10.92,P<0.05);IPA中IL-6mRNA含量明显高于NIPA,差异具有统计学意义(t=9.45,P<0.05);IPA中VEGF mRNA含量明显高于NIPA,差异有统计学意义(t=11.21,P<0.05)。见图2、表2。

表2 IPA及NIPA中TNF-α IL-6 VEGF mRNA水平表达结果

3 讨 论

目前,侵袭性垂体腺瘤治疗,主要选择手术作为治疗方法,这样可以最大限度地消除占位效应,但术后也会发生很多脑脊液漏、尿崩等并发症。通过实验观察TNF-α、IL-6和VEGF三项指标在侵袭性垂体腺瘤中的表达水平明显高于无侵袭性垂体腺瘤,这也提示三项指标对侵袭性垂体腺瘤的发生和进展可能具有一定的推动作用。

TNF-α是一种小分子蛋白质,是单核细胞与巨噬细胞在活化过程中产生,无论是病理还是生理,如细胞免疫、肿瘤免疫、炎症反应等,TNF-α都起着重要的作用[5]。肿瘤组织之所以会对病体进行侵袭,主要原因在于肿瘤血管的形成,TNF-α在IL-8蛋白表达方面起着推动作用。不仅可以加快肿瘤血管的生长,而且可以加速内皮细胞的增殖[6]。出现肿瘤血管后,在IL-8的作用下,血管内皮细胞发生明显收缩,这就加大了血管内皮细胞间空隙,受此影响,肿瘤细胞侵袭能力得到提高。此外,TNF-α还可以增加内皮细胞与肿瘤细胞的粘附力,在这种粘附力的干扰下,肿瘤细胞大量附着在细胞外基质,促使垂体腺瘤细胞侵袭正常组织与器官的能力得到增强,从而促进了侵袭性垂体腺瘤的发生和进展。有研究表明,冈田酸与TNF-α作用具有相似性,比如在二者作用下,热休克蛋白27与成纤维细胞波形蛋白将发生磷酸化,最后形成磷酸化蛋白,具有促进肿瘤细胞生长的效果,从刺激效应角度分析,TNF-α远超于冈田酸,两者都能引起DNA的损伤[7]。在垂体腺瘤发展为侵袭性垂体腺瘤的过程中,TNF-α其中可能起到了上述作用。目前,多项研究表明,感染引起的慢性炎症与多个生物肿瘤的发生有一定的相关性,接近20%[8]。IL-6是临床上常见的炎症因子,对侵袭性垂体腺瘤的生长也有一定的作用,作为炎症信号扩增的关键因子,细胞因子、丝氨酸蛋白酶、粘附分子等是其调节基因,肿瘤的侵袭转移与这些调节基因相关。作为一种生长因子的IL-6具有多功能自分泌或旁分泌的特点,对肿瘤细胞起双向调节作用,刺激增殖和抑制分化。脑组织内的垂体前叶滤泡星形细胞是产生IL-6的主要部位,在gp130家族中也是重要的信号蛋白之一。血液循环是IL-6作用于垂体组织的途径之一,但并非唯一,由于垂体细胞也能释放IL-6,其主要作用主要是抑制垂体细胞生长,减少激素分泌。此外,IL-6可以通过刺激血管生长促进肿瘤细胞增殖,可以延长肿瘤细胞生存时间,使得肿瘤细胞凋亡得到延缓,并且能够令肿瘤细胞快速生长,进而出现远处转移和对化疗药物的耐药性。目前抗肿瘤治疗的方法很多,目前被公认最有效的方法则是抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达。在肿瘤发展期间,VEGF有推动作用,其作用主要表现在促进肿瘤血管生成、肿瘤细胞进展和浸润[9]。肿瘤细胞生长和侵袭所需的新生血管生成到成熟的过程需要复杂的多信号和多因子传递,这也是肿瘤细胞生成乃至具有侵袭性的重要条件。最新研究结果表明,VEGF通过MAPK、PI3K/Akt等途径诱发细胞内信号转导产生作用,显示激活细胞增殖的功能。本实验表明,VEGF在IPA的表达与在NIPA的表达相比,前者明显高于后者,这就意味着垂体腺瘤侵袭生长时, VEGF具有推动作用。

本实验根据免疫组织化学及RT-PCR结果分析,与NIPA相比TNF-α、IL-6、VEGF在IPA组织中在分子、蛋白水平上含量较高,在垂体腺瘤呈现不断侵袭的状态下,这三者接起到促进作用,并为治疗IPA提供一定靶点的理论依据。本文的研究采用少量标本,以单中心为主,为进行更深入的探究,这可能为侵袭性垂体腺瘤的新治疗方法提供一定的理论基础,后期将收集更多的样本进行充填。