CircRNA YAP1对股骨头微血管内皮细胞血管生成的作用研究

日夏提·帕尔哈提, 翟 生, 吕 青

(新疆医科大学第五附属医院骨科中心, 新疆 乌鲁木齐 830000)

类固醇糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)频繁大量使用可引起激素性股骨头坏死(steroids-induced ONFH,SONFH),这是非创伤性股骨头坏死的主要类型[1,2]。SONFH目前具说服力的科学假说之一是GCs的使用显著抑制了股骨头血管生长,导致股骨头供血减少引起骨坏死[3]。然而,该过程的具体调控机制至今未明。Wnt/β-catenin信号在多种肿瘤模型和疾病中参与血管生成的调控,也包括股骨头坏死模型,最近研究表明,Wnt/β-catenin信号可被多个结构稳定的环状RNA(circRNA)密切调控[4]。yes相关蛋白1(YAP1)由位于人类染色体11q22a(17,18)的YAP基因编码,在SONFH中密切调控血管的管形态发生[5],circRNA YAP1是最近被发现的来源于YAP1的circRNA,已明确circRNA YAP1可以促进BMSC和前成骨细胞的成骨分化[4]。但是,circRNA YAP1对微血管内皮细胞生长的作用并不清楚,尽管YAP1已经被证实能激活Wnt1/β-catenin信号并可以促进骨血管的生成[6],但是circRNA YAP1对SONFH中的Wnt1/β-catenin信号蛋白和骨血管生成调控作用不清楚。因此,本研究分离了SONFH模型大鼠的股骨头微血管内皮细胞(microvascular endothelial cell,MVECs),进行培养,并观察MVECs细胞过表达circRNA YAP1对股骨头MVECs血管生成的影响,并基于Wnt1/β-catenin信号探讨circRNA YAP1的调控机制。

1 材料与方法

1.1试剂与耗材:无特定病原(Specified Pathogen Free,SPF)级成年雄性SD大鼠(体重250g±20g)60只购于新疆医科大学实验动物中心。甲基强的松龙购于上海辉瑞公司。pcDNA3.1+真核过表达载体空质粒(pcDNA-NC)、过表达circRNA YAP1的pcDNA3.1+真核表达载体粒(pcDNA-YAP1)、Lipofectamine®3000均购于上海吉玛公司。Wnt1/β-catenin信号通路拮抗剂dickkopf-1购于美国MCE公司。基质胶Matrigel购于美国BD公司。兔抗-CD31、Wnt1、β-catenin、VEGF-A和Vimentin的一抗和驴抗兔二抗以及FITC偶联的山羊抗兔二抗均购于英国Abcam公司。

1.2动物给药和分组:随机数表法将60只大鼠分为两组,分别命名为SONFH组和Ctrl组,每组n=30。SONFH组,肌肉注射甲基强的松龙20mg·kg-1·d-1,每周连续3d,每天1次,连续3周。Ctrl组,肌肉注射生理盐水,注射体积及频率同SONFH组。3周后 micro-CT扫描观察股骨头的形态学变化。并测量Ctrl组和SONFH组的空骨陷窝、骨小梁数目以及骨小梁长度的变化。随后按照随机数表法分配各组大鼠的后续实验研究,包括苏木素伊红(HE)染色(10只)、股骨头MVECs的分离培养(10只),qRT-PCR实验(5只)和Western blot实验(5只)。

1.3HE染色:将1.2中用于HE染色的各组大鼠安乐死,并分离股骨头组织,根据HE染色试剂盒提供的说明进行染色,用以检测股骨头的病理变化。固定脱钙后,取体积为0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm大小的组织(组织表面积为2.5 cm2)。切片固定,行HE染色酒精脱水,二甲苯清洗3次,中性香脂封片。最后,在显微镜下获得图像。

1.4股骨头MVECs分离培养:将1.2中用于股骨头MVECs分离培养的各组大鼠安乐死,无菌条件下急性分离Ctrl组和SONFH组的股骨头组织,用手术刀片削去软组织和软骨,用骨钳将股骨头内的松质骨咬成骨粒转入装有DMEM培养基的50mL离心管。根据文献进行MVECs的分离纯化[7,8]。使用免疫荧光标记法评估细胞纯度。将分离得到的Ctrl组和SONFH组的MVECs用含10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基培养24h,培养条件为37℃,5% CO2。直接收集细胞用于qPCR和Western blot检测。另外,将SONFH组的MVECs继续培养(条件同上,每24h换液)用于细胞转染和给药处理。

1.5免疫荧光法检测CD31鉴定股骨头的MVECs:收集Ctrl组和SONFH组贴壁的MVECs爬片,4%甲醛固定细胞15min,用0.5%Triton X-100进行20min灌通。用PBS洗3次。随后用抗体封闭液封闭30min.。细胞用CD31(1∶500)一抗室温孵育细胞12h。然后将载玻片与FITC偶联山羊抗兔二抗(1∶5000)在37℃孵育1h。细胞核用DAPI染色(1∶5000)。在荧光显微镜(莱卡,德国)下观观察并获取图像。用ImageJ软件计算平均荧光强度。

1.6细胞转染和分组:根据制造商的说明,使用Lipofectamine®3000试剂对MVECs细胞进行转染。将来源于SONFH组的MVECs细胞接种于6孔板(20万细胞/孔)中。细胞分为pcDNA-NC组、pcDNA-YAP1组、pcDNA-YAP1+dickkopf-1组,共3组。pcDNA-NC组细胞用8μg/mL的pcDNA-NC转染24h。pcDNA-YAP1组细胞用8μg/mL的pcDNA-YAP1转染24h。pcDNA-YAP1+dickkopf-1组细胞用500μg/L dickkopf-1同时联合8μg/mL的pcDNA-YAP1转染24h。收集各组细胞沉淀进行后续分析。

1.7qRT-PCR检测circRNA YAP1的表达:收集1.2中用于qRT-PCR检测大鼠的股骨头组织、1.3中分离纯化的MVECs细胞、1.4中各组MVECs细胞,根据制造商说明使用Trizol试剂提取总RNA。根据制造商说明将提取的总RNA反转录为cDNA。采用StepOnePlusTM系统和SYBR Green Master Mix进行qPCR实验。GAPDH作为内参基因。用相对定量方法(2-ΔΔCt)计算表达水平的倍数变化。引物由上海生工生物技术有限公司合成:circ RNA YAP1 正:5’-TGCTGTCCCAGATGAACGTC-3’;circ RNA YAP1 反:5’-GGTTCATGGCAAAACGAGGG-3’。GAPDH 正:5'-ATG ACT CTA CCC ACG GCA AG-3';GAPDH 反:5’-CTG GAA GAT GGT GAT GGG TT-3'。

1.8Western blot:收集1.2中用于Western blot检测的大鼠股骨头组织,1.3中分离纯化的MVECs细胞,1.4中各组MVECs细胞,用RIPA裂解缓冲液提取各组细胞蛋白样品,用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电泳后蛋白转移到PVDF膜,用5%脱脂奶粉室温下封闭60min。PVDF膜分别与Wnt1(1∶1000)、β-catenin(1∶1000)、VEGF-A(1∶1000)、vimentin(1∶1000)、GAPDH(1∶2000)的一抗在4℃孵育过夜。接下来,用TBST中洗掉膜上抗体,并与二抗(1∶2000)在室温孵育60min,显色后使用ImageJ软件分析条带灰度值。GAPDH作为内参蛋白。

1.9CCK-8法检测细胞增殖能力:根据CCK-8试剂盒制造商的说明。将1.4中的各组MVECs细胞接种至6孔板(5×103个/孔)孵育24h,随后细胞与CCK-8共孵育2h,之后使用酶标仪在450nm处测量光密度(OD)值。

1.10细胞迁移实验:用美国康宁Transwell测定室检测细胞的迁移能力。将1.4中的各组MVECs细胞(1×104/200μL DMEM+1% FBS)装入上孔,下孔插入24孔板,下孔中有500μL完全培养基。培养24h后,将上层迁移至下层的细胞用4%中性缓冲福尔马林固定,0.1%结晶紫染色15min。在显微镜下观察通过统计迁移细胞数来量化迁移率。

1.11小管形成实验:在24孔板中预先涂抹200μL的人工基质胶Matrigel。将1.4中的各组MVECs细胞(每孔1×105个细胞)接种到培养皿中,与完全培养基培养24h。在显微镜下观察毛细血管样结构,通过计算每孔管的数量来量化成管能力。

2 结 果

2.1大鼠circRNA YAP1和Wnt1/β-catenin信号通路蛋白的表达:造模3周后,micro-CT扫描结果和HE染色显示Ctrl组的10只大鼠股骨头均表现为健康状态,无坏死,骨小梁致密规则,无空骨陷窝,而SONFH组10只大鼠均出现重度股骨头坏死,包括股骨头形态恶化,伴有大量的空骨陷窝,骨小梁数目减少,骨小梁长度减小特征(图1A和1B)。表明SONFH的造模成功。与Ctrl组比,SONFH组股骨组织中Wnt1和β-catenin的蛋白表达量均显著减少,差异均有统计学意义(P=0.009,0.012),见图1C和表1。而与Ctrl组比,SONFH组股骨组织中circRNA YAP1的表达水平也明显降低(约73%),差异有统计学意义(P=0.014),见表1。

表1 大鼠股骨组织中Wnt1和β-catenin蛋白和circRNA YAP1的表达水平

图1 大鼠股骨组织和Wnt1/β-catenin信号通路蛋白的表达的观察A.micro-CT对大鼠股骨头扫描的结果(200×);B.HE染色观察大鼠股骨头组织病理变化,黑色箭头表示空骨陷窝(200×);C.Western blot法检测Wnt1/β-catenin信号通路蛋白Wnt1和β-catenin在股骨头组织中的表达变化

2.2股骨头MVECs的鉴定:用免疫荧光分析细胞中表达的CD31以鉴定分离的股骨头MVECs。可见细胞均呈现CD31绿色荧光,经过统计两组MVECs的纯度超过95.0%,见图2,表明Ctrl组和SONFH组的股骨头MVECs分离纯化成功。

图2 荧光显微镜下用CD31鉴定股骨头MVECs(200×)

2.3股骨头MVECs中circRNA YAP1、Wnt1、β-catenin的表达:与Ctrl组比,SONFH组MVECs中circRNA YAP1的表达水平明显降低(约85%),差异有统计学意义(P=0.014,表2)。与Ctrl组比,SONFH组MVECs中Wnt1和β-catenin的蛋白表达量均显著减少,差异均有统计学意义(P=0.005,0.007),见图3和表2。

表2 大鼠股骨头MVECs中circRNA YAP1 Wnt1 β-catenin的表达水平

图3 Western blot法大鼠股骨头MVECs中Wnt1/β-catenin信号通路蛋白的表达

2.4circRNA YAP1通过激活Wnt1/β-catenin信号通路促进股骨头MVECs增殖:与pcDNA-NC组比,pcDNA-YAP1组的circRNA YAP1表达上调(P<0.05),而且pcDNA-YAP1组的Wnt1和β-catenin表达均上调(均P<0.05),见图4和表3。与pcDNA-YAP1组比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1组的circRNA YAP1表达变化无统计学意义(P>0.05),而Wnt1和β-catenin的表达均下调(均P<0.05),见图4和表3。与pcDNA-NC组比,pcDNA-YAP1组的股骨头MVECs的增殖率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),而与pcDNA-YAP1组比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1组增殖率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 circRNA YAP1通过激活Wnt1/β-catenin信号通路促进股骨头MVECs增殖

图4 Western blot法检测circRNA YAP1过表达和Wnt信号阻断对Wnt1和β-catenin表达的影响

2.5circRNA YAP1通过激活Wnt1/β-catenin信号通路促进大鼠血管内皮细胞的迁移:与pcDNA-NC组比,pcDNA-YAP1组的股骨头MVECs的迁移细胞数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),而与pcDNA-YAP1组比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1组迁移细胞数明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5和表4。

表4 circRNA YAP1通过激活Wnt1/β-catenin信号通路促进股骨头MVECs的迁移

图5 Transwell 小室法检测circRNA YAP1过表达和Wnt信号阻断对细胞迁移数的影响(400×,结晶紫染色)

2.6circRNA YAP1通过激活Wnt1/β-catenin信号通路促进大鼠血管内皮细胞的血管生成:与pcDNA-NC组比,pcDNA-YAP1组的股骨头MVECs的管形成数和分枝节点数均明显增加,差异有统计学意义(均P<0.05),而与pcDNA-YAP1组比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1组管形成数和分枝节点数明显降低,差异有统计学意义(均P<0.05)。见图5A和表5。与pcDNA-NC组比,pcDNA-YAP1组的血管生成标志物Vimentin和VEGF-A的蛋白表达水平均上调(均P<0.05),而与pcDNA-YAP1组比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1组Vimentin和VEGF-A的蛋白表达水平都降低(均P<0.05)。见图6和表5。

表5 circRNA YAP1通过激活Wnt1/β-catenin信号通路促进股骨头MVECs的血管形成

图6 Tube形成实验检测circRNA YAP1过表达和Wnt信号阻断对细胞血管生成的影响(400×)

3 讨 论

在本研究中,SONFH大鼠股骨头组织中circRNA YAP1表达均较Ctrl组下调。其次,在分离的大鼠股骨头MVECs中观察到一致的结果。这表明了circRNA YAP1在SONFH中可能扮演重要作用。对SONFH组的MVECs过表达circRNA YAP1可明显观察到促进股骨头MVECs细胞的增殖、迁移、血管生成能力均增加,同时Wnt1/β-catenin信号蛋白表达增加。而当使用Wnt1/β-catenin信号的拮抗剂dickkopf-1后,circRNA YAP1过表达对MVECs细胞的增殖、迁移、血管生成的诱导作用被明显削弱。这表明,circRNA YAP1通过Wnt1/β-catenin信号通路促进SONFH MVECs的迁移和血管生成。

本研究利用强的龙松干预3周,明显诱导了大鼠的股骨头坏死,这与以往的研究报道一致[8]。经过分离MVECs,本研究在体外观察到SONFH组股骨头MVECs的增殖率明显低于Ctrl组,证实了GCs可抑制MVECs的增殖。据报道,GCs加速了SONFH大鼠股骨头MVECs的凋亡,并引起不少数量的非编码RNA的差异表达[8]。本研究发现强的龙松导致股骨头组织以及体外股骨头MVECs中的circRNA YAP1都明显下调。表明circRNA YAP1很有可能参与了股骨头MVECs的调控。因此,为了观察circRNA YAP1对股骨头MVECs,本研究在体外过表达了circRNA YAP1,结果显著促进了SONFH大鼠股骨头MVECs的迁移能力和管结构形成能力。本研究通过进一步验证血管生成标志物VEGF-A和vimentin的表达,发现circRNA YAP1过表达能够明显上调VEGF-A和vimentin的蛋白表达,从而进一步确认了circRNA YAP1对MVECs血管生成具有促进作用。这些结果表明,circRNA YAP1在促进SONFH大鼠股骨头血管生成中具有重要作用。

Wnt1/β-catenin信号通路在内皮血管生成中具有重要作用,例如,激活Wnt1/β-catenin信号通路可以促进糖尿病视网膜病变患者视网膜血管新生,在血管生成中发挥重要作用[9],其可以通过促进血管内皮细胞的增殖和迁移以及血管生成因子VEGFA的表达来促进血管生成[10]。本研究发现SONFH大鼠股骨头组织和MVECs中Wnt1/β-catenin的表达均较Ctrl组下调,而且股骨头MVECs细胞中过表达circRNA YAP1促进了Wnt1/β-catenin信号通路的激活。研究表明,在骨髓间充质干细胞和前成骨细胞中circRNA YAP1也可以激活Wnt1/β-catenin信号通路[4],这支持了本研究的结果。另外,dickkopf-1蛋白是特异性Wnt/β-Catenin信号通路的天然抑制剂,可以介导SONFH的调控,如敲低dickkopf-1可减少地塞米松诱导股骨头坏死中的BMSCs凋亡[11]。本研究发现过表达circRNA YAP1可以激活Wnt1/β-catenin信号通路,但是利用dickkopf-1蛋白阻断Wnt1/β-catenin信号通路却并不影响circRNA YAP1的表达,但却减弱了过表达circRNA YAP1对大鼠股骨头MVECs的增殖能力、细胞迁移能力、管结构形成能力、VEGF-A、vimentin的促进作用。表明circRNA YAP1是Wnt1/β-catenin通路的上游调控靶点,通过激活Wnt1/β-catenin信号通路促进SONFH股骨头MVECs的迁移和血管生成。

综上所述,本研究结果表明,SONFH大鼠股骨头中circRNA YAP1下调,而circRNA YAP1在体外过表达可以明显促进MVECs的血管生成,此功能表明circRNA YAP1可用于预防或治疗激素诱导的股骨头坏死。在机制方面,我们发现circRNA YAP1通过激活Wnt1/β-catenin通路促进SONFH 股骨头MVECs的血管生成。