从昼夜规律对肝脏凝血系统的影响探讨子午流注的基因背景*

李晶津 王佳玉

1.首都医科大学附属北京天坛医院心脏及大血管中心 (北京, 100070) 2.首都医科大学附属北京天坛医院神经心脏中心

子午流注源于中医针灸“人与天地相应”的观点,依据人体功能活动、 病理变化受自然界气候变化等影响规律辨证循经按时取穴的针灸治疗方法,后来发展成为中医药因时制宜(“因时施治”“因时针灸”“因时给药 ”)的理论基础,是较早的“时间生物学”“时间治疗学”的思想和实践[1,2]。肝脏作为最重要的消化腺,其生理功能和相关生物大分子表达、代谢活性有着很明显的昼夜节律性[3],已有研究报道昼夜节律对肝脏的糖代谢、脂代谢以及胆汁酸代谢等均起到重要作用[4,5]。肝脏也是凝血因子的合成器官,对于维持凝血系统功能有重要作用[6],但昼夜节律是否影响肝脏凝血系统功能仍有待研究。本研究通过对小鼠肝组织基因表达谱的分析,筛选具有昼夜节律性的凝血功能相关基因,探讨昼夜节律对凝血系统功能的影响,为子午流注的微观生物学背景研究提供思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象 利用高通量基因表达数据库(GEO数据库),通过关键字“昼夜节律”“小鼠”“肝脏组织样本”“RNA-测序”搜索GEO数据集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)获得相关研究样本数据资料:GSE57313检测样本数为24例(Dicer敲除型小鼠vs野生型小鼠)[7],GSE70497检测样本数为24例(昼夜节律基因Artnl敲除型小鼠vs野生型小鼠)[8]。

1.2 生物信息学分析 利用昼夜节律基因和调节因子数据库(CirGRDB,http://cirgrdb.biols.ac.cn)分析上述高通量数据,获得昼夜节律基因表达谱[9],检索Reactome生物数据库获得凝血信号通路相关基因[10],通过韦恩图筛选出具有昼夜节律性的凝血相关基因,利用注释、可视化和集成发现数据库(DAVID, https://david.ncifcrf.gov/)进行基因功能注释分析。

2 结果

2.1 小鼠肝脏中昼夜节律性的凝血功能相关基因分析 通过生物信息学分析,发现小鼠肝脏中昼夜节律性的凝血功能相关基因有22个(P<0.05),根据凝血功能分为巨核细胞发育与血小板生成的相关因子12个、细胞表面与血管壁的相互作用因子5个、血小板激活和聚集因子4个、血小板止血因子2个。见表1。22个基因的功能注释分析见图1,2。

图2 小鼠肝脏中昼夜节律性的凝血功能相关基因GO富集分析

表1 小鼠肝脏中昼夜节律性的凝血功能相关基因

2.2 小鼠肝脏中凝血功能相关基因昼夜节律表达特征 小鼠肝脏中昼夜节律性的凝血功能相关基因有17个在夜间表达增高(Pde9a、Ppp2r1b、Tuba4a、Vcl、Cxadr、Itga5、Kras、Slc16a1、Tek、Jmjd1c、Phf21a、Prkaca、Prkar2a、Rcor1、Tubb2a、Tubb2b、Tubb4b),其中Pde9a、Tuba4a、Cxadr、Prkar2a的表达夜间最高;Gna12、Rapgef4、Maff、Sh2b3、Wee1日间表达升高,其中Gna12、Rapgef4、Maff、Wee1的表达日间最高。敲除昼夜节律调节关键因子Arntl后凝血相关基因表达的昼夜节律性消失。见表2,图3。

图3 小鼠肝脏中昼夜表达特征显著的凝血相关基因(●为野生型,■为昼夜节律因子Arntl-/-敲除型)

表2 小鼠肝脏中凝血功能相关基因的昼夜节律数据

3 讨论

子午流注的名称最早载于金·阎明广《子午流注针经》,该学说以“天人相应”的整体观为理论基础,是中医时间医学内容中对昼夜节律划分最为严格的一种。子午流注学说认为人体十二经脉气血流动按一日昼夜时间更替表现出规律性的盛衰变化,随着后世医家对时间医学的认识不断发展,现已广泛应用于中医针灸治疗、辨证、用药和养生[12,13]。传统医学认为肝主藏血、主疏泄,其排毒、修复、合成及储血等功能具有时间节律的变化规律,但其科学内涵和生物学基础一直未能阐明。

本研究采用系统生物学技术与方法,重点探讨肝脏凝血功能的昼夜节律特性,以期探索子午流注学说的基因背景。本研究通过分析小鼠肝脏的高通量基因表达谱,发现肝脏部分凝血功能相关基因具有昼夜节律性,其中大部分基因与血小板的生成、激活、聚集和止血密切相关。这一点与凝血因子节律性的相关实验研究相印证,有研究报道昼夜节律调节因子CLOCK和BMAL能够调节血栓形成[14],高龄小鼠BMAL1缺失更易导致内皮功能受损并形成血栓[15]。通过分析肝脏凝血功能相关基因的昼夜节律特征,本研究表明这些基因大部分在夜间表达逐渐升高,其节律性受到节律因子的调控,节律调节因子敲除后相关基因节律性消失。夜间表达最高的基因包括磷酸二酯酶9A(Pde9a)、微管蛋白α 4a(Tuba4a)、CXADR Ig样细胞粘附分子(Cxadr)、蛋白激酶cAMP依赖性II型调控亚基α(Prkar2a),磷酸二酯酶(PDEs)能够水解细胞内第二信使cAMP或cGMP,终结第二信使传导的生化作用。PDE9A与其他PDEs家族成员相比,对cGMP具有最高的亲和力和选择性,特异性调节心脏钠尿肽依赖性cGMP信号,作为心肌细胞和肌肉肥厚的调节剂,在大脑中参与学习和长期记忆等认知功能。Tuba4是一种微管蛋白,能够结合GTP、构成细胞骨架的结构成分,参与有丝分裂中心体Nlp的丢失以及折叠前蛋白和TriC/CCT在肌动蛋白和微管蛋白折叠中的协同作用。CXADR能够结合整合素,参与先天免疫系统和Ⅰ类MHC介导的抗原加工和递呈;也可介导驻留在上皮细胞中的γ - δ T细胞激活,增殖并产生细胞因子和生长因子,刺激上皮组织修复。PRKAR2A能够结合泛素蛋白连接酶和cAMP,可能与多种α激酶锚定蛋白相互作用,并决定cAMP依赖性蛋白激酶的亚细胞定位,调节蛋白质从核内体到高尔基体并进一步到内质网的运输。日间表达最高的凝血功能基因包括G蛋白亚基α 12(Gna12)、Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子4(Rapgef4)、MAF BZIP转录因子F(Maff)、Wee1 G2检查点激酶(Wee1)。GNA12参与TOR信号的调控和蛋白酶体泛素依赖性蛋白分解代谢过程的调控;通过激活RhoA/ROCK信号通路上调促炎细胞因子的产生,促进肿瘤细胞的侵袭和转移;抑制独立于Rho激活的CDH1介导的细胞粘附过程;与NAPA协同促进CDH5定位到质膜;还可能通过TOR信号级联调控细胞迁移。Rapgef4具有鸟酰核苷酸交换因子活性,可结合GTPase,参与能量代谢整合和整合素信号传导途径;可能参与神经递质受体定位到突触后特化膜的调节和突触后组织的调节。Maff具有转录因子活性,能够结合序列特异性DNA,如催产素受体(OTR)基因启动子中的US-2 DNA元件,以增强OTR基因在妊娠期的表达,也可能参与细胞应激反应。Wee1基因编码蛋白是一种酪氨酸激酶,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,可催化CDC2/细胞周期蛋白B激酶的抑制性酪氨酸磷酸化,并通过保护细胞核免受细胞质活化的CDC2激酶的影响,协调DNA复制和有丝分裂之间的过渡。

本研究发现肝脏中凝血相关基因的表达具有昼夜节律性,其中大部分基因夜间表达逐渐升高,其节律性受到节律因子的调控。这可能是子午流注的重要基因背景,也为“因时防治”动脉粥样硬化和从肝论治提供新的研究思路。本研究存在的不足之处是,研究结果还需要利用人类群体数据进行验证,具体的凝血基因昼夜调节机制需要进一步实验研究。