二陈汤对肥胖小鼠肝脏脂代谢及AMPK/ACC/SREBP1信号通路作用机制研究*

张付民 罗 政 周炎涛 张岱阳

湖北省恩施州中心医院脊柱外科 (湖北 恩施, 445000)

肥胖为诱发非酒精性脂肪肝炎、糖尿病、肿瘤、冠心病等疾病的重要因素,当前全球肥胖患者已突破21亿人,成为全球性的公共卫生问题[1]。目前,肥胖的治疗方式主要有锻炼、饮食控制、减肥手术和药物治疗,其中药物治疗主要包括奥利司他、西布曲明和氯卡色林等[2]。尽管抗肥胖药物的问世给肥胖患者带来了曙光,但其引起的副作用也日益显现,因此迫切需要寻找更为有效且副作用低的治疗药物。

中医学认为肥胖发病主要与痰湿、湿热有关,临床实践也证实人参、白术、茯苓、黄连等健脾祛湿和清热燥湿类中药对肥胖患者具有一定疗效[3,4]。二陈汤源自《太平惠民和剂局方》,具有燥湿化痰、理气和中之功,为中医治疗痰邪的经典方剂。近年来,一些研究证实二陈汤可通过降脂、抗氧化应激、抑制炎症和调节肠道菌群等途径改善高脂饮食诱导肥胖模型的肝损伤[5-9]。AMPK/ACC/SREBP1信号通路具有降脂、抗炎的作用,调节该信号通路则可改善肥胖模型的肝脏脂质代谢紊乱和肝脏炎症病变[10,11]。研究发现二陈汤可通过激活AMPK改善肥胖模型大鼠脂质代谢紊乱[12]。尽管二陈汤抗肥胖的作用已得到广泛认可,但尚不能确定其是否可通过调节AMPK/ACC/SREBP1信号通路改善肥胖模型的肝脏脂质代谢紊乱。为此,本研究将通过高脂饮食建立肥胖模型小鼠,并给予模型小鼠二陈汤干预,通过观察小鼠脂质代谢及肝脏炎性病变,以及AMPK/ACC/SREBP1信号通路中关键分子表达水平,以揭示二陈汤改善肥胖的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性C57BL/6J小鼠,60只,6周龄,体质量20～22 g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司[许可证号:SCXK(辽)2020-0001]。动物饲养于湖北省恩施州中心医院实验中心,动物房温度保持在23～26℃,相对湿度维持在50%～60%,实验期间动物自由饮水和摄食。

1.1.2 主要药品及试剂 参考文献[7]确定二陈汤药物组成及药物剂量,即二陈汤由半夏、橘红各15 g,茯苓 9 g,甘草4.5 g组成,所有中药材由湖北省恩施州中心医院中医部提供。水煎药物,将药物浓缩成每毫升含生药0.435 g的水煎液,置4℃冷藏备用。奥利司他胶囊(重庆华森制药股份有限公司,批号:国药准字H20103180)。ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司,批号分别为C009-2-1、C010-2-1、C011-2-1、A111-1-1、A110-1-1、A113-1-1、A112-1-1)。小鼠IL-1β试剂盒、小鼠IL-6试剂盒、小鼠TNF-α试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号分别为PI301、PI326、PT512)。HE染色液、油红O染色液、小鼠IL-8试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号分别为G1120、G1261、SEKM-0046)。AMPKα兔多克隆抗体、p-AMPKα(Thr172)兔多克隆抗体、ACC兔多克隆抗体、p-ACC(Ser79)兔多克隆抗体、SREBP1兔多克隆抗体和β-actin兔单克隆抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司,货号分别为A1229、AP0116、A15606、AP0298、AC026)。

1.2.3 实验器材 XPR6U/AC型电子天平(上海梅特勒-托利有限公司);3H24RI型离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);N-9848型组织研磨仪(北京赫得科技有限公司);Minux S700A型石蜡切片机(深圳瑞沃德生命科技有限公司);EnVision型酶标仪(美国PerkinElmer公司);EPS-600型电泳仪、Tanon 1600型凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、造模及给药 按照随机数字生成表将C57BL/6J小鼠随机分为空白组(Control)组、模型(Model)组、奥利司他(Orlistat)组和二陈汤(ECD)组,每组15只。参考文献[10,11]予高脂饮食建立肥胖小鼠模型。Control组小鼠给予普通饮食,其余3组小鼠则给予高脂饮食[蔗糖(10%)、猪油(14%)、胆固醇(2%)、胆酸钠(0.2%)及基础饲料(72.8%)],连续饲养12周。饲养结束后,尾静脉取血,通过检测ALT、AST、TC、TG的含量判断造型是否成功。经检测Model组、Orlistat组和ECD组小鼠分别有12只、12只、13只造模成功。选取造模成功的小鼠进行干预,即从第13周开始Control组和Model组小鼠给予等体积的生理盐水,Orlistat组和ECD组分别按照15.6 mg/(kg·d)和0.87 g/(kg·d)的剂量灌胃奥利司他胶囊和二陈汤水煎液,持续干预4周。

1.2.2 小鼠体重、肝脏湿重及肝体比值检测 治疗后,从每组随机选取8～11只小鼠,记录体重,摘眼球取血,取血后置离心机以3 000 r/min离心10 min,取上清液,分装后置-80℃备检。取血后,解剖腹腔,剥离肝脏,记录各组小鼠的肝脏湿重,分装后置-80℃备检。计算各组小鼠肝体比值,肝体比值(%)=肝脏湿重/体重。

1.2.3 小鼠血清ALT、AST检测 将上述部分冻存的血清(n=8～11)恢复至室温,参照试剂盒说明书检测各组小鼠血清中ALT、AST的表达水平。

1.2.4 小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C检测 将上述部分冻存的血清(n=8～11)恢复至室温,参照试剂盒说明书检测各组小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的表达水平。

1.2.5 小鼠肝组织HE染色 用6%水合氯醛麻醉(4 ml/kg)剩余小鼠(n=4),解剖胸腔,经心脏灌注4%多聚甲醛溶液,肝脏发白后取肝脏,置4%多聚甲醛溶液固定24 h。固定后石蜡包埋肝组织,用切片机切取5 μm厚的切片。使用二甲苯和梯度乙醇对切片进行脱蜡和透明,置苏木素染液染色15 min,自来水洗片,置1%盐酸酒精分化3 s。自来水下洗片,置伊红染色液染色3 s。二甲苯和梯度乙醇脱水,封片,置显微镜下观察切片,拍照。

1.2.6 小鼠肝组织油红O染色 取上述石蜡包埋的肝组织,切片机切取10 μm厚的切片,使用二甲苯和梯度乙醇对切片进行脱蜡和透明。将切片置60%异丙醇浸泡20 s,再置油红O染色液染色10 min。染色后将切片置60%异丙醇分化5 s,蒸馏水洗片,滤纸吸干残留水分,甘油明胶封片。显微镜下观察切片,拍照。

1.2.7 ELISA检测小鼠肝组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α检测 取上述冻存的肝组织100 mg(n=8～11),加入9倍体积的PBS,置组织研磨仪匀浆。研磨后以3 000 r/min离心15 min,取上清液,分装备检。参照ELISA试剂盒说明书依次检测各组小鼠肝组织中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平。

1.2.8 Western blot检测小鼠肝组织AMPK/ACC/SREBP1信号通路相关蛋白的表达水平 取上述冻存的肝组织100 mg(n=4),加入RIPA裂解液1 ml,置组织研磨仪研磨,以12 000 r/min离心15 min,取上清液,用BCA蛋白试剂盒测定样品蛋白浓度。根据蛋白浓度使用Loading buffer稀释样品,100℃煮沸10 min,置-20℃保存备检。制备8%的分离胶和5%的浓缩胶,每孔上样10 μl,依次电泳和转膜。置5%脱脂奶粉封闭2 h,加入一抗AMPKα(1∶1 000)、一抗p-AMPKα(1∶1 000)、一抗ACC(1∶1 000)、一抗p-ACC(1∶1 000)、一抗SREBP1(1∶1 000)和一抗β-actin(1∶1 000),置4℃孵育过夜。TBST洗膜,将切片置于稀释后的二抗(1∶10 000),室温孵育1 h;TBST洗膜,向切片表面滴加ECL显色液。凝胶成像仪曝光条带,拍照,用Image J分析条带灰度值。

1.3 统计学方法 采用统计软件SPSS 21.0处理实验数据。采用Shapiro-Wilk检验对各组数据进行正态性分析,实验数据不符合正态性多组间两两比较则采用KruskaL-WallisH检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。符合正态分布则采用单因素方差分析,方差齐性时多组间两两比较采用Bonferroni法,方差不齐时多组间两两比较采用Tamhahe′s T2法,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 二陈汤对肥胖小鼠体重、肝脏湿重及肝体比值的影响 见表1。

表1 二陈汤对肥胖小鼠体重、肝脏湿重及肝体比值的影响

2.2 二陈汤对肥胖小鼠血清ALT、AST的影响 见表2。

表2 二陈汤对肥胖小鼠血清ALT、AST的影响

2.3 二陈汤对肥胖小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影响 见表3。

表3 二陈汤对肥胖小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影响

2.4 小鼠肝组织HE染色结果 Control组小鼠肝细胞结构清晰,细胞排列整齐,未见明显的脂肪变性和气球样病变。Model组小鼠肝细胞间隙增加,细胞排列欠规则,有明显的脂肪变性和气球样病变,可见炎性细胞浸润。Orlistat组和ECD组小鼠肝细胞间隙减少,细胞排列较整齐,脂肪变性和气球样病变,可见少量的炎性细胞浸润。见图1。

图1 各组小鼠肝组织HE染色图 (400×)

2.5 小鼠肝组织油红O染色结果 Control组小鼠肝细胞形态正常,细胞质可见少量且分布均匀的红色脂滴。Model组小鼠肝细胞肿大,细胞质内有大量的红色脂滴。Orlistat组和ECD组小鼠肝细胞肿大减轻,且细胞质内红色脂滴减少。见图2。

图2 各组小鼠肝组织油红O染色图 (400×)

2.6 二陈汤对肥胖小鼠肝组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的影响 见表4。

表4 二陈汤对肥胖小鼠肝组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的影响

2.7 二陈汤对肥胖小鼠肝组织AMPK/ACC/SREBP1信号通路相关蛋白的影响 与Control组比较,Model组小鼠肝组织中p-AMPKα/AMPKα、p-ACC/ACC的表达水平显著降低(P<0.01),而SREBP1的表达水平显著升高(P<0.01)。与Model组比较,Orlistat组和ECD组小鼠肝组织中p-AMPKα/AMPKα、p-ACC/ACC的表达水平升高(P<0.01,P<0.05),而SREBP1的表达水平显著降低(P<0.01)。见表5、图3。

1.Control组;2.Model组;3.Orlistat组;4.ECD组

表5 二陈汤对肥胖小鼠肝组织AMPK/ACC/SREBP1信号通路相关蛋白的影响

3 讨论

中医学认为肥胖之人具有“多痰”“多湿”的病理表现[4,13]。痰和湿本属同类,具有相资互长的属性,然二者的生成与脾主运化失调有关,如《素问·至真要大论》言:“诸湿肿满,皆属于脾”。脾失运化的发生又与过食肥甘厚味、暴饮暴食关系密切,如《素问·痹论》言:“饮食自倍,脾胃乃伤”。《诸病源侯论·虚劳痰饮候》也有相似的论述,并言:“劳伤之人,脾胃虚弱,不能克消水浆,故为痰饮也”。因此,治疗肥胖当注重应用健脾祛湿化痰法[14]。二陈汤源自《太平惠民和剂局方》,具有燥湿化痰、理气和中之功,被奉为治疗痰湿的基础方。二陈汤中半夏燥湿化痰,橘红健脾理气化痰祛湿,茯苓健脾渗湿,甘草健脾和中、调和诸药,全方共凑燥湿化痰、理气和中之功。总之,二陈汤主治功效与肥胖发病病机相契合,且临床和动物实验也证实其具有抗肥胖的作用。因此,本研究以二陈汤为研究对象。

肝脏脂质代谢紊乱为肥胖发病过程中的重要环节,改善肝脏脂质代谢对于肥胖的结局具有重要意义。研究证实连续给予啮齿类动物12周及以上高脂饮食可导致肝脏脂质代谢紊乱[15,16]。本研究也发现在给予小鼠12周高脂饮食后,小鼠血清中TC、TG、LDL-C的表达水平显著升高(P<0.01),且HDL-C的表达水平显著下调(P<0.01),这表明高脂饮食可导致小鼠肝脏脂质代谢紊乱。综合HE染色和油红O染色结果,课题组认为高脂饮食可以诱导肥胖小鼠肝脏脂质代谢紊乱,这一结果与前期研究结论一致[5,6]。课题组在给予模型小鼠二陈汤治疗后,小鼠肝脏脂质沉积好转,血清中TC、TG、LDL-C的表达水平下调且HDL-C的表达水平上调(P<0.01,P<0.05),这表明二陈汤可以改善肥胖小鼠肝脏脂质代谢紊乱。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)为细胞能量代谢的感受器,具有调节能量代谢、脂质代谢、炎症、自噬和凋亡的作用[17]。AMPK家族由AMPKα、AMPKβ和AMPKγ三个亚单位组成,其中APMKα为其主要亚单位[18]。AMPKα在苏氨酸172位点(Thr172)磷酸化后可促使乙酰辅酶A羧化酶(ACC)在丝氨酸79位点(Ser79)磷酸化,磷酸化的ACC又可进一步抑制下游胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)的表达,从而最终改善脂质代谢紊乱[19-21]。激活AMPK/ACC信号通路可抑制SREBP1表达,并最终改善肥胖模型肝脏脂质代谢紊乱[21]。本研究发现,在给予小鼠高脂饮食后,小鼠肝组织中AMPK和ACC的磷酸化蛋白表达水平下调(P<0.01),而SREBP1的蛋白表达水平增加(P<0.01),这表明高脂饮食可导致小鼠肝脏AMPK/ACC/SREBP1信号通路的异常表达。在给予肥胖小鼠二陈汤治疗后,小鼠肝组织中AMPK和ACC的磷酸化蛋白表达水平上调(P<0.01,P<0.05),且SREBP1的蛋白表达水平下调(P<0.05)。此外,高脂饮食可导致啮齿类动物肝脏炎症病变,AMPK/ACC信号通路的活化则可通过抑制SREBP1的表达,从而抑制促炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的释放[5,6,19-21]。本研究发现,给予小鼠12周高脂饮食后,模型小鼠肝组织中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平明显升高(P<0.01),而二陈汤则可抑制小鼠肝组织中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平(P<0.01,P<0.05)。综合分析上述实验结果,二陈汤可通过调节AMPK/ACC/SREBP1信号通路改善高脂饮食诱导的肝脏脂质代谢紊乱和炎性改变。

上述结果表明,二陈汤可以改善肥胖小鼠的脂质代谢紊乱,其机制可能与其调节AMPK/ACC/SREBP1信号通路有关。本研究初步探讨了二陈汤治疗肥胖的作用机理,但其深入机制还需要进一步研究。因此,课题组下一步将通过体外实验验证其治疗肥胖的主要作用靶点和作用机制。